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  近日，香港科技大學(xué)唐本忠院士團(tuán)隊(duì)在Science伙伴期刊《Research》發(fā)表了題為“A Simple Approach to Bioconjugation at Diverse Levels: Metal-Free Click Reactions of Activated Alkynes with Native Groups of Biotargets without Prefunctionalization” 的研究論文。在該工作中，作者發(fā)展了一種簡單的無金屬參與、無預(yù)修飾生物偶聯(lián)新策略，實(shí)現(xiàn)多級對象的標(biāo)記功能化，如天然高分子、合成高分子、多肽、蛋白質(zhì)、活細(xì)胞、細(xì)菌，甚至無機(jī)材料表面修飾等。

  在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，探索生物分子的結(jié)構(gòu)、示蹤其發(fā)揮作用的內(nèi)在機(jī)制與過程非常重要，但是采用什么技術(shù)手段使這些內(nèi)在過程“可視化”非常富有挑戰(zhàn)。目前，多數(shù)生物分子和生物材料自身沒有可以用作有效觀察的熒光，通常采用偶聯(lián)熒光分子或者其它成像單元來實(shí)現(xiàn)生物靶標(biāo)分子的示蹤。生物偶聯(lián)反應(yīng)通常要求反應(yīng)效率高，不產(chǎn)生額外副產(chǎn)物或僅產(chǎn)生氮?dú)饣蛩鹘y(tǒng)的生物偶聯(lián)策略往往需要重金屬催化，如銅，或需要復(fù)雜的多步前修飾處理，重金屬殘留造成的潛在毒性不利于后續(xù)生物應(yīng)用；待修飾對象的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性限制了其預(yù)修飾；如蛋白質(zhì)是生命體中重要的構(gòu)筑單元，其結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜，預(yù)修飾本身已存在顯著挑戰(zhàn)。另外，針對活細(xì)胞的全細(xì)胞成像，甚至生命體的熒光標(biāo)記始終是個難題，傳統(tǒng)采用基因手段，但操作復(fù)雜，不確定性高�？傊�，由于被修飾生物對象的復(fù)雜性，迫切需要發(fā)展一種廣泛適用、不需要預(yù)修飾的直接偶聯(lián)策略，用于不同生物靶標(biāo)分子甚至生命體的直接修飾標(biāo)記，具有重要學(xué)術(shù)與轉(zhuǎn)化價值。

  在過去二十余年里，唐本忠院士團(tuán)隊(duì)一直關(guān)注三鍵單體的高分子聚合方法學(xué)。近幾年，唐本忠院士團(tuán)隊(duì)秦安軍教授等發(fā)展了炔類單體與胺類單體、硫醇單體、醇類單體等的高效點(diǎn)擊聚合反應(yīng) (J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 5437-5443; Macromolecules 2015, 48, 7782-7791; Macromolecules 2014, 47, 1325-1333; Adv. Fun. Mater. 2010, 20, 1319-1328; Chem.-A Eur. J. 2017, 23, 10725-10731; Polym. Chem. 2017, 8, 2713-2722)�；诖耍仗票局以菏繄F(tuán)隊(duì)通過活化炔與胺基、硫醇、醇的高效偶聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多級對象的生物偶聯(lián)標(biāo)記 (圖1)。并分別舉例進(jìn)行概念性說明，如基于伯胺與活化炔的生物偶聯(lián)策略，可用于修飾殼聚糖或一步法簡易實(shí)現(xiàn)PEGylation, 偶聯(lián)產(chǎn)物具有發(fā)光特性，可用于細(xì)胞成像等 (圖2)。

圖1. 基于活化炔的多級生物偶聯(lián)平臺可以實(shí)現(xiàn)多級對象的無預(yù)修飾偶聯(lián)熒光標(biāo)記

圖2. 基于伯胺與活化炔的生物偶聯(lián)策略修飾殼聚糖和簡易實(shí)現(xiàn)PEGylation

  其次，基于巰基與活化炔的高效偶聯(lián)可用于合成高分子端基修飾 (如RAFT聚合的高分子產(chǎn)物)，為后續(xù)合成高分子的生物應(yīng)用提供了眾多可能；基于羥基與活化炔的偶聯(lián)可用于多糖改性，此過程僅需要加入催化量的有機(jī)堿，不需要添加重金屬催化劑 (圖3)。在廣泛驗(yàn)證了活化炔與胺基、硫醇和醇類反應(yīng)性以后，作者利用多肽和蛋白質(zhì)固有的伯胺或巰基進(jìn)行無金屬催化的生物偶聯(lián)標(biāo)記，并對多肽和蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能進(jìn)行初步驗(yàn)證 (圖4)。

圖3. 基于巰基與活化炔的偶聯(lián)用于合成高分子端基修飾 (如RAFT聚合的高分子產(chǎn)物), 基于羥基與活化炔的偶聯(lián)也可用于多糖改性

圖4. 基于多肽和蛋白質(zhì)固有的伯胺、巰基進(jìn)行無金屬催化的生物偶聯(lián)標(biāo)記

  隨后，作者嘗試將活化炔用于復(fù)雜體系的偶聯(lián)標(biāo)記研究。如將活化炔小分子直接用于細(xì)胞標(biāo)記染色，并以不含炔的熒光小分子或炔被加成后的熒光產(chǎn)物進(jìn)行平行試驗(yàn)，驚奇地發(fā)現(xiàn)，活化炔熒光探針可以在短短2分鐘內(nèi)完成全細(xì)胞染色，而對照分子不能在如此短的時間里完成染色 (圖5)�；诨罨才c胺基或巰基快速偶聯(lián)特征，作者推測活化炔小分子首先與細(xì)胞膜表面富含的胺基和巰基的蛋白質(zhì)快速反應(yīng)，這些蛋白質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)快速轉(zhuǎn)運(yùn)過程中同時帶入標(biāo)記的熒光探針，從而實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞的快速標(biāo)記。

  最后，作者分別選取典型的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，進(jìn)一步將上述三種熒光分子與這些細(xì)菌分別培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)活化炔熒光分子在2分鐘內(nèi)完成陽性菌快速染色，而兩個對照熒光分子與兩種典型的陽性菌共孵育30分鐘都無法染色陽性菌；另外，包括活化炔熒光分子在內(nèi)的三種熒光分子均無法在短時間內(nèi)染色標(biāo)記革蘭氏陰性菌；綜合分析，陽性菌膜表面富含大量突起的磷壁酸組分，其含有大量伯胺基元，可以快速與活化炔熒光分子反應(yīng)，從而快速染色陽性菌，而陰性菌膜表面沒有磷壁酸組分，且其復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)本身就不利于小分子物理滲入 (圖6)，預(yù)期基于活化炔的熒光探針將為細(xì)菌快速識別篩選提供重要幫助。

圖5. 基于活化炔的熒光探針可以快速全細(xì)胞染色，兩分鐘可以完成染色

圖6. 基于活化炔的熒光探針快速識別染色革蘭氏陽性菌并染色，兩分鐘可完成

  基于活化炔的高效偶聯(lián)，作者還驗(yàn)證了該偶聯(lián)策略在無機(jī)材料表面修飾上的應(yīng)用，如微米級二氧化硅球的熒光標(biāo)記�？傊�，本文基于活化炔廣泛的基團(tuán)反應(yīng)性，針對生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的不同靶標(biāo)分子和需求，如PEGylation、合成高分子、天然多糖、多肽、蛋白質(zhì)，活細(xì)胞快速染色、活細(xì)菌識別標(biāo)記等，進(jìn)行了概念性驗(yàn)證，證明活化炔在無金屬生物偶聯(lián)、生物醫(yī)學(xué)中具有重要應(yīng)用前景。

  該工作近期發(fā)表在Science合作期刊Research, 2018, 3152870，通訊作者為唐本忠院士 (香港科技大學(xué)課題組主頁：http://tangbz.ust.hk/tbz.html)，第一作者為胡祥龍博士和博士生趙學(xué)千，其中，胡祥龍博士受到“香江學(xué)者計(jì)劃”資助，在香港科技大學(xué)唐本忠院士課題組開展研究工作，現(xiàn)任職于華南師范大學(xué)，其個人簡介如下：http://biop.scnu.edu.cn/a/20150812/33.html。

  論文鏈接：https://spj.sciencemag.org/research/2018/3152870/