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NJIT許曉陽教授、上海交大章雪晴教授 AFM: 脂質(zhì)體-聚合物雜化納米結(jié)構(gòu)基因遞送平臺用于可冷凍保存的DNA、mRNA新冠疫苗
2022-07-24  來源：高分子科技

  新冠疫情導(dǎo)致全球性大流行病，對公共衛(wèi)生和全球經(jīng)濟(jì)造成災(zāi)難性影響已感染超過 5 億人，導(dǎo)致全球超過 610 萬人死亡（根據(jù)世界衛(wèi)生組織于 2022 年 4 月的數(shù)據(jù)）。通過各方不懈的研究與合作，新一代的核酸疫苗以創(chuàng)紀(jì)錄的方式被研發(fā)出來并及時(shí)地部署接種， 其中包括由Pfizer-BioNTech和Moderna開發(fā)的兩款mRNA脂質(zhì)體納米粒（mRNA-LNP）新冠疫苗。這兩款mRNA-LNP疫苗能夠引發(fā)高水平的中和抗體滴度并且有著高達(dá) 95%的疫苗有效性，在預(yù)防 COVID-19上顯示出巨大潛力。盡管如此，這兩款mRNA-LNP新冠疫苗受到有限保存期和缺乏穩(wěn)定性的限制，需要將它們保存在 -60 °C 至 -80 °C，以及 -15 °C 至-25°C的環(huán)境中，并且同時(shí)需要高成本的超冷鏈的運(yùn)輸條件。目前，冷凍干燥技術(shù)已被應(yīng)用于延長包括小分子藥物、疫苗和基于蛋白質(zhì)的藥物在內(nèi)的多種藥劑的保質(zhì)期。在冷凍保護(hù)劑的作用下，冷凍干燥能夠溶劑對疫苗的水解作用并且能夠使其以干粉形式下長期儲存。由于目前的 mRNA-LNP 新冠疫苗全部都是儲存在水相溶液中的，因此，這增加了 mRNA 和 LNP 水解的作用從而導(dǎo)致疫苗的不穩(wěn)定而失效。



  近期，美國新澤西理工學(xué)院許曉陽教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交通大學(xué)藥學(xué)院章雪晴教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一類新型脂質(zhì)體修飾的聚（β-氨基酯）命名為L-PBAE，并進(jìn)一步與PLGA-PEG自組裝成“Particle-in-Particle”（PNP）新型PNP納米結(jié)構(gòu)用于DNA和mRNA的體外與體內(nèi)的遞送（圖1）。在眾多PNP 的納米材料庫中，研究人員證明了PNP/C12-PBAE作為性能最佳的納米粒子，能夠在體外和體內(nèi)高效地遞送DNA和mRNA，并且呈現(xiàn)出增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效果、緩慢持續(xù)的DNA和mRNA的釋放和至少 12 個(gè)月在-20 °C的條件下凍干保存而不會損失轉(zhuǎn)染效率的出色穩(wěn)定性（圖2）。在包裹刺突蛋白編碼的DNA和mRNA后，脂質(zhì)體修飾的 PNP 新冠疫苗即使在 -20°C 凍干儲存 12 個(gè)月后，仍能在小鼠模型中成功引發(fā)刺突蛋白的特異性抗體和 Th1 型的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)（圖3）。這種新型脂質(zhì)-聚合物雜化的 PNP 納米粒子系統(tǒng)為遞送DNA 和 mRNA提供了一種新的策略和方法，并且該遞送系統(tǒng)具有長期凍干儲存的能力。這項(xiàng)工作以“Lipid-polymer hybrid “Particle-in-Particle” nanostructure gene delivery platform explored for lyophilizable DNA and mRNA COVID-19 vaccines”為題發(fā)表在《Advanced Functional Materials》（IF=19.92）（DOI：10.1002/adfm.202204462）。該論文的第一作者為新澤西理工學(xué)院化工與材料系博士研究生李忠宇。


圖 1. PNP/L-PBAE NPs 的表征。(A) PNP/L-PBAE NPs 的一般示意圖，PNP由三部分組成：(i) L-PBAE/基因納米復(fù)合物嵌入整個(gè) PLGA-PEG 納米外殼中，(ii) PLGA層提供持續(xù)釋放和保護(hù)嵌入的L- PBAE/基因納米復(fù)合物，(iii) 外 PEG修飾的納米顆粒表面。(B) PNP/L-PBAE NPs 的代表性 TEM 圖像和 (C) 代表性納米粒子圖像的放大部分。(D) 未嵌入 L-PBAE 的空PLGA-PEG NPs 的代表性 TEM 圖像和 (E) L-PBAE/基因納米復(fù)合物的代表性 TEM 圖像。(F) PNP/L-PBAE NPs 的大小和 zeta 電位由動態(tài)光散射確定。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（標(biāo)準(zhǔn)偏差）。 


圖 2. PNP/C12-PBAE NPs 在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的綜合評定。(A) 在不同時(shí)間點(diǎn)由負(fù)載 GFP 質(zhì)粒 (pGFP) 的PNP/C12-PBAE NPs 轉(zhuǎn)染的 Hek 293 細(xì)胞的熒光圖像以及 FACS 結(jié)果。(B) 轉(zhuǎn)染后 GFP 陽性細(xì)胞群的總結(jié)和 (C) 根據(jù) FACS 結(jié)果顯示的 GFP 陽性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度 (MFI)。(D) 在不同時(shí)間點(diǎn)由負(fù)載 mCherry mRNA (mCherry) 的PNP/C12-PBAE NPs 轉(zhuǎn)染的 Hek 293 細(xì)胞的熒光圖像以及FACS 結(jié)果。(E) 根據(jù) FACS 結(jié)果對轉(zhuǎn)染后 mCherry 陽性細(xì)胞群和 (F) mCherry 陽性細(xì)胞的 MFI 進(jìn)行總結(jié)。(G) 與 C12-PBAE NPs 相比，PNP/C12-PBAE NPs具有對 pGFP 和 (H) mRNA 的緩慢持續(xù)釋放的特性。(I) pGFP和 mRNA負(fù)載的PNP 納米顆粒的瓊脂糖凝膠電泳分析。(J) 與對照組相比，在特定時(shí)間點(diǎn)注射載有熒光素酶 mRNA (mLuc) 的 PNP (n=3) 后 BALB/c 小鼠的體內(nèi)生物發(fā)光圖像。(K) 使用 pGFP 和 (L) mCherry 作為報(bào)告基因?qū)?nbsp;PNP/C12-PBAE NPs 進(jìn)行長期儲存后的評估，通過 FACS 結(jié)果進(jìn)行總結(jié)并標(biāo)準(zhǔn)化為新鮮的 PNP 基因表達(dá)。(M) 在注射后 1 天后記錄 BALB/c 小鼠模型中 PNP 制劑和 ALC-0315 LNP（輝瑞制劑）之間的熒光素酶表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)一式三份重復(fù)，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。


圖 3. PNP 新冠疫苗的體外表征和接種小鼠的體液免疫反應(yīng)。(A) 在 Hek 293 細(xì)胞上轉(zhuǎn)染 DNA-PNP 和 mRNA-PNP 疫苗后刺突蛋白表達(dá)的體外蛋白質(zhì)印跡（WB）。用多克隆抗 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白和抗 GAPDH 作為上樣對照對細(xì)胞裂解物進(jìn)行探測。(B) 用 DNA-PNP（上排）和 mRNA-PNP（下排）轉(zhuǎn)染的 Hek 293 細(xì)胞的體外免疫熒光染色。用多克隆抗 SARS 冠狀病毒 2 刺突糖蛋白和 FITC 標(biāo)記的二抗測量刺突蛋白的表達(dá)。細(xì)胞核用 DAPI 復(fù)染，熒光圖像在明場、DAPI、FITC 和合并通道下拍攝（比例尺，50 μm）。(C) 小鼠免疫和樣品收集計(jì)劃示意圖。在第0天和第14天分別給予初免和加強(qiáng)疫苗注射，在第0天、第13天、第21天和第35天收集小鼠血清。在第42天取出接種小鼠的脾臟。(D) 通過 ELISA (n = 5) 確定的 mRNA-PNP 疫苗的刺突蛋白特異性 IgG 抗體滴度。(E) mRNA-PNP 疫苗的 SARS-CoV-2 刺突假病毒中和抗體 IC50 滴度 (n=5) 。 (F) 使用 mRNA-PNP 接種小鼠血清 (n=5) 進(jìn)行針對野生型原始株SARS-CoV-2 毒株病毒的斑塊減少中和試驗(yàn) (PRNT)。(G) 通過 ELISA (n = 5) 確定的 DNA-PNP 疫苗的刺突蛋白特異性 IgG 抗體滴度。(H) DNA-PNP 疫苗的 SARS-CoV-2 刺突假病毒中和抗體 IC50 滴度 (n=5) 。 (I) 使用 DNA-PNP 接種小鼠血清 (n=5) 對野生型原始株SARS-CoV-2 株病毒進(jìn)行噬菌斑減少中和試驗(yàn) (PRNT)。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD。使用具有多重比較檢驗(yàn)的單向方差分析計(jì)算顯著性（ns，不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。


  該工作是團(tuán)隊(duì)關(guān)于可凍干并且可長期保存的DNA和mRNA新冠疫苗相關(guān)研究的最新進(jìn)展之一。以脂質(zhì)體雜化的陽離子聚合物L-PBAE和PLGA-PEG為基礎(chǔ)，開發(fā)出新型PNP聚合物納米結(jié)構(gòu)用于基因遞送以及新冠疫苗的研發(fā)，并且為可長時(shí)間凍干保存的納米顆；蜻f送系統(tǒng)提供了一種新的解決方案。


  原文鏈接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202204462

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