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華中大陳莉莉/武漢理工樊李紅《Carbohyd. Polym.》：負載nHA的明膠/藻酸鹽水凝膠具有物理和生物活性用于頜面骨修復
2022-09-25  來源：高分子科技

  考慮到其對功能和結構修復的要求，臨界大小的頜面骨缺損一直是一項艱巨的臨床挑戰(zhàn)。在本研究中，由明膠 (Gel)、20 mg/mL 海藻酸二醛 (ADA)、4.5 mg/mL Ca 2+制備可注射原位形成雙交聯(lián)水凝膠和硼砂。復合水凝膠的改進性能可以很好地適應和覆蓋面部骨骼缺損的不規(guī)則幾何形狀，支撐面部結構并傳導咀嚼力。他們通過納米羥基磷灰石 (nHA) 的裝飾，創(chuàng)新性地構建了一種具有生物活性的多孔結構。高度有序、均勻且尺寸受限的多孔表面充當了一個交互式成骨平臺，用于巨噬細胞和骨髓衍生干細胞 (BMSCs) 之間的交流和相互作用。有效的巨噬細胞-BMSC 串擾很好地解釋了負載 nHA 的明膠/藻酸鹽水凝膠 (nHA@Gel/ADA) 在修復臨界尺寸顱骨缺損中的顯著效率。總的來說，這里構建的復合水凝膠可能作為復雜頜面骨缺損修復過程中的一種有前途的替代方案。


  華中科技大學協(xié)和口腔醫(yī)院陳莉莉教授和武漢理工大學化學化工與生命科學學院樊李紅教授合作開展了一種在新型 nHA@ADA/Gel 中同時增強物理特征和生物活性效應。雙交聯(lián)策略賦予水凝膠優(yōu)異的可注射性、自愈性和形狀適應性，是修復面部不規(guī)則骨缺損所必需的。nHA的修飾不僅有助于水凝膠增強機械性能，而且促進表面外觀重塑為尺寸受限的多孔表面，適用于巨噬細胞和骨髓間充質干細胞之間的有效串擾和隨后的成骨。這里提出的nHA@ADA/Gel成功地整合了成骨的固有特征和生物活性功能，因此為開發(fā)專門用于修復頜面部骨缺損的新型生物材料提供了廣闊的機會。相應結果以題為 “nHA-loaded gelatin/alginate hydrogel with combined physical and bioactive features for maxillofacial bone repair”發(fā)表于Carbohydrate Polymers期刊。 


圖1.化學交聯(lián)和離子交聯(lián)（Ca2+）并用nHA修飾的復合ADA-Gel水凝膠示意圖。nHA中動態(tài)解離的PO43-和Ca2+與生物聚合物相互作用形成緊密緊湊的結構。其在頜面部骨缺損中的應用獲得了改善的生物醫(yī)學和力學性能。通過巨噬細胞和骨髓間充質干細胞之間的交互調節(jié)，復合水凝膠顯著加速了骨修復過程。


  圖2展示了復合水凝膠的物理化學性質以及在頜面骨修復中的適用性。同時，通過流變學研究證明了復合水凝膠具有優(yōu)異的粘彈性和可注射性。結果表明，添加30% nHA顆？梢愿纳扑z的粘彈性行為，這與HA-30擁有的最高粘度一致。圖3顯示了nHA@ADA/Gel粘附性能與力學性能，由于面部骨組織承擔著支持咀嚼、吞咽和語言等功能性機械力的責任，因此作為骨愈合材料的水凝膠應具有足夠的機械強度和韌性。結果表明HA-30組在韌性性能方面表現(xiàn)出優(yōu)異的表現(xiàn)，與其他組相比，上調了2-3倍。因此，添加Ca2+在水凝膠內形成離子交聯(lián)以及在修飾nHA后進一步穩(wěn)定水凝膠結構可以顯著改善復合水凝膠的機械性能，這對于設計和制備滿足頜面機械要求的生物材料至關重要骨修復。 


圖2. A)凝膠化前后制備的復合水凝膠的外觀。B)HA-30在不同形狀模具中的適應性。C)附著在關節(jié)上的HA-30的柔韌性。D）復合水凝膠的粘彈性行為。E) 復合水凝膠在37℃下的稀釋剪切行為，以及可注射物體的照片（以HA-30為例）。F)HA-30在37℃下的交替應變掃描。G)HA-30宏觀自愈特性的照片。 


圖3. A)HA-30 對塑料、玻璃、橡膠、木材和骨頭的粘附照片。B) 復合水凝膠粘附在新鮮豬皮上的應力-應變曲線。C) 復合水凝膠粘附在新鮮豬皮上的最大粘附強度。D) 復合水凝膠的壓縮應力-應變曲線。E) 復合水凝膠在 5-15% 應變下的壓縮模量。F) 復合水凝膠的拉伸應力-應變曲線。G)復合水凝膠的韌性。


  圖4探索了 nHA@ADA/Gel 水凝膠是否以及如何驅動巨噬細胞 M2 極化，他們檢測了在兩種不同條件下已建立的 M2 巨噬細胞相關標志物的表達。結果顯示，HA-30 可以通過 HA-30 本身的直接作用或通過 BMSCs 對 HA-30 的間接影響來誘導 M2 樣巨噬細胞的極化。他們推測 HA-30 對巨噬細胞的直接免疫調節(jié)功能可能部分歸因于水凝膠系統(tǒng)中均勻分布的 nHA。通過分泌 CCL2 和 CCL4 等趨化因子，MSCs 間接誘導巨噬細胞募集到再生部位。同時，BMSCs 通過 iNOS 和 COX2 依賴性信號通路對 M2 樣巨噬細胞的表型轉移發(fā)揮免疫調節(jié)功能。圖5嘗試確定水凝膠衍生的 M2 巨噬細胞對 BMSC 成骨分化的影響。結果顯示，極化的 M2 巨噬細胞通過 CCL2、CXCL8 和 SDF-1 有助于將 BMSCs 和骨祖細胞募集到缺損區(qū)域，并促進 BMSCs 介導的骨形成通過分泌信號因子來處理和增強基質礦化？傊瑥秃纤z可作為巨噬細胞和骨髓間充質干細胞之間有效串擾的交互平臺。BMSCs 的促極化作用和巨噬細胞對 nHA@ADA/Gel 的促成骨作用共同形成正反饋回路，從而加速骨再生過程。 


圖4. A）復合水凝膠直接誘導巨噬細胞抗炎分化的過程示意圖。B)在水凝膠上直接培養(yǎng)的THP-1細胞中用CD206（紅色）進行免疫熒光染色的共聚焦顯微鏡圖像（比例尺=10μm）。C) 直接在水凝膠上培養(yǎng)的THP-1細胞中CD206的相對平均熒光強度。D、E和F)相關IL12A、TGFβ和CCL2的RT-qPCR結果直接在水凝膠上培養(yǎng)的THP-1細胞中的mRNA表達水平。G)在水凝膠上培養(yǎng)的h-BMSCs間接誘導巨噬細胞抗炎分化的過程示意圖。H) 在水凝膠上培養(yǎng)的h-BMSCs間接誘導的THP-1細胞中用CD206進行免疫熒光染色的共聚焦顯微鏡圖像（比例尺 = 10 μm）。I) 在水凝膠上培養(yǎng)的 h-BMSCs 間接誘導的THP-1細胞中 CD206 的相對平均熒光強度。J、K和L)在水凝膠上培養(yǎng)的h-BMSCs間接誘導的THP-1細胞中CCR2、TGFβ和CCR5 mRNA表達的 RT-qPCR結果。*p<0.05,**p< 0.01, *** p< 0.001,****p<0.0001。 


圖5. A) 在復合水凝膠上培養(yǎng)的 THP-1 細胞誘導 h-BMSCs 成骨分化的過程示意圖。B) 7 天后的 ALP 染色結果（比例尺 = 50 μm）。C 和 D) 第 7 天不同條件下 h-BMSCs 表達的骨相關標志物的免疫染色。COL1（綠色）、RUNX2（綠色）和 DAPI（藍色）（比例尺 = 10 μm）。E 和 F) ImageJ 軟件對 COL1 和 RUNX2 的相對平均熒光強度分析。G、H、I、J) 骨相關基因包括OSX、RUNX2、OPN和COL1的表達。*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001 和 ****p< 0.0001。

  圖6為了驗證 nHA@ADA-Gel 在誘導新骨形成中的作用，他們使用 SD 大鼠顱骨缺損模型評估了復合水凝膠的體內骨再生潛力。結果表明 HA-30 作為體內骨再生的生物活性候選物表現(xiàn)良好。結合體外結果，他們共同證明了nHA@ADA/Gel可以通過提供一個相互調節(jié)巨噬細胞和BMSCs的平臺來加速新骨的形成。以往的研究已經觀察到不同類型的nHA負載生物材料的直接成骨作用，其生物學功能主要歸因于nHA本身和Ca2+的緩慢釋放。在這里，他們觀察到修飾nHA后水凝膠表面的特殊形態(tài)重塑，它作為生物活性交互平臺通過巨噬細胞/間充質干細胞串擾進行有效骨修復。 


圖6. A) 顱骨標本的圖像。紅色圓圈表示新骨骼和宿主骨骼之間的邊界。B) 顱骨標本的 H&E 染色（比例尺 = 500 μm 和 125 μm）。C、D 和 E) 修復缺陷區(qū)域中 COL1（綠色）、RUNX2（綠色）和 CD68+（綠色）CD206+（紅色）巨噬細胞的免疫熒光染色（比例尺 = 40 μm 和 20 μm）。F 和 G) 骨體積/總體積 (BV/TV) 和小梁數(shù) (Tb.N) 的形態(tài)計量分析。* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001 和 **** p < 0.0001。H、I 和 J) 注射復合水凝膠后 6 周顱骨缺損內骨再生的代表性 CT 圖像。黃色三角形表示新生骨。黃色圓圈表示新骨骼和宿主骨骼之間的邊界。


  綜合可見，華中科技大學協(xié)和口腔醫(yī)院陳莉莉教授和武漢理工大學化學化工與生命科學學院樊李紅教授展示了在新型 nHA@ADA-Gel 中同時增強物理特征和生物活性效應。雙交聯(lián)策略賦予水凝膠優(yōu)異的可注射性、自愈性和形狀適應性，是修復面部不規(guī)則骨缺損所必需的。nHA的修飾不僅有助于水凝膠增強機械性能，而且促進表面外觀重塑為尺寸受限的多孔表面，適用于巨噬細胞和骨髓間充質干細胞之間的有效串擾和隨后的成骨。這里提出的nHA@ADA-Gel成功地整合了成骨的固有特征和生物活性功能，因此為開發(fā)專門用于修復頜面部骨缺損的新型生物材料提供了廣闊的機會。


  該研究成果以“nHA-loaded gelatin/alginate hydrogel with combined physical and bioactive features for maxillofacial bone repair”為題，發(fā)表于Carbohydrate Polymers，2022，298，120127（DIO: 10.1016/j.carbpol.2022.120127）。武漢理工大學化學化工與生命科學學院碩士研究生周小虎為論文第一作者，華中科技大學協(xié)和口腔醫(yī)院博士研究生孫紀威和碩士研究生沃珂琪為論文共同第一作者，中科技大學協(xié)和口腔醫(yī)院陳莉莉教授和武漢理工大學化學化工與生命科學學院褚瑩瑩講師、樊李紅教授為論文共同通訊作者。


  論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.120127

  下載：nHA-loaded gelatin/alginate hydrogel with combined physical and bioactive features for maxillofacial bone repair

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（責任編輯：xu）
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