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福州大學(xué)楊建民、石賢愛(ài)課題組 Acta Biomater.：具有細(xì)菌原位檢測(cè)與清除功能的智能傷口敷料
2023-12-18  來(lái)源：高分子科技

  感染會(huì)阻礙傷口愈合過(guò)程，甚至可能導(dǎo)致危及生命的并發(fā)癥，如組織壞死、器官衰竭和敗血癥。因此，早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療感染性病原體對(duì)于防止傷口進(jìn)一步惡化至關(guān)重要，并有利于傷口護(hù)理。目前，臨床檢測(cè)病原體的金標(biāo)準(zhǔn)主要包括平板培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、測(cè)序等。雖然這些方法相對(duì)靈敏可靠，但復(fù)雜的工作流程，包括繁瑣的樣品預(yù)處理和數(shù)小時(shí)至數(shù)天的檢測(cè)時(shí)間，可能會(huì)錯(cuò)過(guò)治療機(jī)會(huì)。此外，這些檢測(cè)方法的應(yīng)用受到對(duì)精密儀器和熟練操作人員需求的限制，使其難以在醫(yī)療資源有限的地區(qū)或在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、可現(xiàn)場(chǎng)操作的傷口感染性病原體檢測(cè)分析策略。當(dāng)前，無(wú)需實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的即時(shí)檢測(cè)(POCT)方法已經(jīng)成為一種可行的替代方法，也是病原體檢測(cè)研究的焦點(diǎn)。雖然POCT方法在檢測(cè)傷口細(xì)菌方面卓有成效，但它們通常沒(méi)有考慮到傷口護(hù)理的其他重要方面，如傷口保護(hù)、抗菌特性和促進(jìn)愈合。此外，以往主要基于傷口溫度、pH變化判定傷口感染程度的方式，其準(zhǔn)確性往往受環(huán)境和生理干擾因素較大。



  近日，福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院楊建民、石賢愛(ài)課題組，將即時(shí)檢測(cè)(POCT)策略和光動(dòng)力抗菌(PDT)技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一種新型智能敷料，用于原位檢測(cè)和清除傷口致病菌。該研究以羧甲基殼聚糖和氧化海藻酸鈉為基質(zhì)，加入4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG)和二氧化鈦包覆的上轉(zhuǎn)化納米顆粒(UCNPs@TiO2)制備智能水凝膠敷料。該敷料能夠與細(xì)菌分泌的β-葡萄糖醛酸酶(β-GUS)反應(yīng)生成4-MU，后者在紫外光激發(fā)下發(fā)出裸眼可見(jiàn)的藍(lán)色熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行可視化檢測(cè)。合成的UCNPs@TiO2光敏劑，能夠在近紅外光照射下生成活性氧(ROS)，從而具有較高的PDT抗菌性能。同時(shí)，能夠根據(jù)細(xì)菌檢測(cè)的診斷結(jié)果，調(diào)整近紅外光照射的時(shí)間和頻率。此外，構(gòu)建了一套基于智能手機(jī)的便攜式檢測(cè)系統(tǒng)，并配備了自主開(kāi)發(fā)的Android APP，可在幾秒鐘內(nèi)對(duì)病原體進(jìn)行原位檢測(cè)。該研究采用大腸桿菌—金黃色葡萄球菌混合菌液構(gòu)建SD大鼠全層皮膚創(chuàng)面感染模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了智能傷口敷料的體內(nèi)抗菌活性和促愈合能力。 


圖1. 智能傷口敷料示意圖。(a) 智能傷口敷料結(jié)構(gòu)。(b) 同時(shí)原位檢測(cè)和清除傷口部位的致病菌。(c) 紫外光下細(xì)菌原位可視化檢測(cè)機(jī)制。(d) 近紅外光下抗菌機(jī)理。

  已知MUG分子含有糖苷鍵，可被β-GUS酶解成4-MU和β-D-葡萄糖醛酸，而4-MU在紫外光照射下可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。由于常見(jiàn)的傷口病原菌，如大多數(shù)腸桿菌科、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌都能分泌β-GUS，因此將MUG摻入透明度較高的水凝膠敷料中可以實(shí)現(xiàn)傷口細(xì)菌的原位可視化檢測(cè)。該研究分別通過(guò)肉眼和智能手機(jī)檢測(cè)裝置觀察水凝膠敷料—大腸桿菌共孵育后藍(lán)色熒光強(qiáng)度變化。結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)時(shí)間下，熒光強(qiáng)度隨細(xì)菌濃度的增加而增加，表明可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的可視化檢測(cè)與感染程度判定。但與基于智能手機(jī)的檢測(cè)裝置相比，裸眼識(shí)別的靈敏度較低。只有當(dāng)細(xì)菌濃度高于106 CFU/mL時(shí)，可以裸眼觀察到顯著熒光強(qiáng)度差異；而在智能手機(jī)檢測(cè)裝置中，細(xì)菌濃度為103 CFU/mL即可觀測(cè)到顯著熒光變化。同時(shí)，ImageJ處理結(jié)果顯示出了類似的變化趨勢(shì)。在此，裸眼的低靈敏度主要是由于紫外線光源的位置和角度變化、水凝膠的表面光反射、環(huán)境光的干擾等導(dǎo)致激發(fā)光強(qiáng)度不一致，這也是裸眼檢測(cè)的共性問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，當(dāng)傷口細(xì)菌數(shù)量達(dá)到105左右時(shí)，通常可被認(rèn)定為感染。因此，雖然可以通過(guò)裸眼觀察識(shí)別已感染的傷口，但為了實(shí)現(xiàn)感染的早期發(fā)現(xiàn)，還是需要借助智能手機(jī)檢測(cè)裝置。 


圖2. (a) 裸眼觀察和(b) 基于智能手機(jī)的檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行大腸桿菌檢測(cè)示意圖以及記錄的熒光照片。


  為了方便檢測(cè)，自主開(kāi)發(fā)了Android APP命名為“Pathogenic Detection”用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和診斷傷口細(xì)菌感染情況。該APP主要用于通過(guò)測(cè)量不同濃度細(xì)菌—智能傷口敷料共孵育的熒光強(qiáng)度（轉(zhuǎn)換為RGB值）來(lái)分類感染水平。如前所述，105 CFU/mL的細(xì)菌量被認(rèn)為是傷口感染的臨界閾值。同時(shí)，為了及時(shí)發(fā)現(xiàn)傷口細(xì)菌，將智能傷口敷料—細(xì)菌共培養(yǎng)1小時(shí)后的熒光強(qiáng)度作為判斷傷口感染的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)分析大量結(jié)果后設(shè)定：當(dāng)RGB值中的B值低于124時(shí)，將感染級(jí)別定義為“Low-risk”；當(dāng)B值處于124—184時(shí)，將感染級(jí)別定義為“Infected”；當(dāng)B值高于184時(shí)，將感染級(jí)別定義為“Severe”。在此，不同的診斷水平可作為選擇相應(yīng)抗菌治療策略的參考。例如，“Low-risk”結(jié)果表示無(wú)需進(jìn)行抗菌治療，而“Infected”結(jié)果則需要立即進(jìn)行PDT抗菌治療。一旦檢測(cè)到“Severe”級(jí)，有必要增加抗菌治療的頻率。此外，該APP與基于智能手機(jī)的檢測(cè)設(shè)備相結(jié)合，可以在幾秒鐘內(nèi)檢測(cè)和診斷傷口感染情況。 


圖3. “Pathogenic Detection”APP手機(jī)界面及檢測(cè)流程，所用智能手機(jī)為小米Redmi K30 Ultra。

  將智能傷口敷料浸入大腸桿菌—金黃色葡萄球菌混合懸液中評(píng)價(jià)其體外細(xì)菌檢測(cè)和抑制能力。在細(xì)菌剛接觸敷料時(shí)，由于沒(méi)有生成4-MU，所有組的B值都處于“Low-risk”水平。此外，未添加細(xì)菌的敷料隨著時(shí)間的推移，B值始終低于100。然而，添加細(xì)菌的敷料在培養(yǎng)3 h后B值增加到150左右，即“Infected”。此外，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)6 h后B值升高至170左右，仍處于“Infected”水平，而敷料+細(xì)菌組的B值約為240，處于“Severe”水平。這種差異主要是由于敷料+細(xì)菌組未經(jīng)近紅外照射（無(wú)抗菌效應(yīng)），因此敷料的熒光強(qiáng)度隨著細(xì)菌的增殖而不斷增加。相反，實(shí)驗(yàn)組在NIR照射下，大部分細(xì)菌在3 h時(shí)被光敏抗菌劑產(chǎn)生的ROS消滅，殘留的β-GUS和細(xì)菌導(dǎo)致熒光信號(hào)增長(zhǎng)緩慢。 


圖4. 智能傷口敷料體外原位致病菌檢測(cè)與抑制測(cè)試。(a) 體外細(xì)菌檢測(cè)及抑制示意圖及(b)試驗(yàn)結(jié)果。(c) 采用基于智能手機(jī)的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)診斷結(jié)果。

  該研究采用全層皮膚缺損SD大鼠，評(píng)價(jià)了智能傷口敷料的體內(nèi)細(xì)菌檢測(cè)及抑制作用。與正常傷口相比，在紫外線照射下，感染傷口可見(jiàn)藍(lán)色熒光。感染創(chuàng)面第0天通過(guò)智能手機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)得B值約為221，明顯高于正常組(約120)，表明創(chuàng)面處于“Severe”感染階段。感染創(chuàng)面B值隨著近紅外光處理逐漸降低，直至與正常組一致，說(shuō)明創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量減少，并得到有效抑制。提取不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面滲出液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。近紅外光處理后的細(xì)菌數(shù)量明顯減少。第6天幾乎沒(méi)有觀察到明顯的菌落。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的存活率均降至5%以下。值得一提的是，該研究中的抗菌治療僅在敷料更換時(shí)進(jìn)行。因此可以推斷，增加抗菌治療次數(shù)將加速細(xì)菌清除效果。以上結(jié)果表明，該智能傷口敷料具有良好的細(xì)菌檢測(cè)和響應(yīng)性抗菌能力，可作為一種新型傷口敷料用于傷口感染的原位檢測(cè)和按需抗菌治療。 


圖5. 智能傷口敷料體內(nèi)原位致病菌檢測(cè)與抑制。(a) 體內(nèi)細(xì)菌檢測(cè)與消滅示意圖。(b) 用裸眼觀察感染和正常SD大鼠傷口敷料的熒光。(c) 基于智能手機(jī)的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。(d) 感染傷口菌落計(jì)數(shù)。

  兼具原位檢測(cè)和清除細(xì)菌的智能傷口敷料可以準(zhǔn)確評(píng)估創(chuàng)面細(xì)菌感染情況，根據(jù)需要進(jìn)行精準(zhǔn)抗菌治療，從而提高創(chuàng)面護(hù)理效率，促進(jìn)創(chuàng)面?zhèn)性化治療。然而，目前這類敷料報(bào)道較少。雖然可以通過(guò)在敷料中嵌入復(fù)雜的生物傳感器或電子元件來(lái)實(shí)現(xiàn)原位細(xì)菌檢測(cè)，但是較高的生產(chǎn)成本和復(fù)雜的傷口護(hù)理方式具有應(yīng)用局限。同時(shí)，以往主要基于傷口溫度、pH變化判定傷口感染程度的方式，其準(zhǔn)確性往往受環(huán)境和人體生理干擾因素較大。此外，盡管使用顏色變化作為傷口感染檢測(cè)是一種方便實(shí)用的方法，但是僅僅依靠裸眼識(shí)別和判斷的視覺(jué)檢測(cè)方法往往受到個(gè)體感官差異的影響。由于當(dāng)前智能手機(jī)的廣泛使用和固有優(yōu)勢(shì)，包括高效率、非侵入性、便攜性以及安裝第三方APP作為信號(hào)讀取器的能力，因此基于智能手機(jī)的POCT方法受到了較高關(guān)注。此外，傷口愈合的實(shí)時(shí)過(guò)程數(shù)據(jù)可以根據(jù)需要傳送給遠(yuǎn)程醫(yī)療人員，從而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程護(hù)理。


  該研究研制了一種能同時(shí)原位檢測(cè)和清除致病菌的智能傷口敷料。其中，細(xì)菌的存在可以通過(guò)跟蹤敷料的藍(lán)色熒光直觀地檢測(cè)出來(lái)。同時(shí)，利用構(gòu)建的基于智能手機(jī)的檢測(cè)系統(tǒng)，在達(dá)到感染極限前對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)和診斷。此外，該智能敷料通過(guò)近紅外照射下的光動(dòng)力抗菌效應(yīng)，能夠有效地按需殺滅創(chuàng)面關(guān)鍵致病菌。該研究提出的智能傷口敷料能夠在早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療感染性病原體，有利于傷口管理。該項(xiàng)成果以“Intelligent Wound Dressing for Simultaneous in situ Detection and Elimination of Pathogenic Bacteria”為題發(fā)表在Acta Biomaterialia期刊上。福州大學(xué)楊建民副教授為本論文第一作者，通訊作者為石賢愛(ài)教授和日本東京都立大學(xué)的毛思鋒助理教授，其中所用的Android APP為福州大學(xué)高躍明教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。該研究工作得到了福建省自然科學(xué)基金、福建省海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展專項(xiàng)等項(xiàng)目的資助。


  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.11.045

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（責(zé)任編輯：xu）
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