華南理工曹曉東教授、高會場副教授團隊 AFM：工程化雙重電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境介導(dǎo)周圍神經(jīng)再生
周圍神經(jīng)在人體分布廣泛，疾病和意外事故造成的組織損傷往往伴隨局部周圍神經(jīng)的缺失或損壞。由于周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難依靠基體實現(xiàn)自我修復(fù)，導(dǎo)致缺損神經(jīng)所控制的感覺和所支配的運動受到影響，顯著影響患者生活質(zhì)量。目前對于長距離周圍神經(jīng)缺損的臨床治療方法主要采用自體神經(jīng)移植。自體移植是臨床的黃金標準，但由于受到供體來源和修復(fù)距離的限制，無法完全滿足臨床需求。近年來人工神經(jīng)導(dǎo)管已成為治療長距離周圍神經(jīng)缺損的重要方法，現(xiàn)有神經(jīng)導(dǎo)管產(chǎn)品因存在缺乏生物活性、無法傳遞電生理信號等問題，對長距離周圍神經(jīng)缺損修復(fù)效果欠佳，難以達到自體移植的修復(fù)效果，更多地作為自體移植后的神經(jīng)保護裝置使用。目前研究以及臨床實踐表明，采用電活性材料構(gòu)建人工神經(jīng)導(dǎo)管，賦予人工神經(jīng)導(dǎo)管導(dǎo)電或自發(fā)電的電活性，構(gòu)建有利于周圍神經(jīng)再生的電生理微環(huán)境，是提高人工神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)效果的有效策略。但目前仍然缺乏具有導(dǎo)電性和自發(fā)電性一體的人工神經(jīng)導(dǎo)管，并且電活性材料在周圍神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用還面臨著起效機制不明確，應(yīng)用形式受限，無法滿足臨床實際手術(shù)需求等挑戰(zhàn)。此外，電活性材料對免疫微環(huán)境的調(diào)控規(guī)律及其促周圍神經(jīng)再生的分子機制尚不清楚。這都極大地限制了電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管在治療周圍神經(jīng)缺損中的應(yīng)用。
針對以上問題，華南理工大學(xué)曹曉東教授與高會場副教授報道了一種具有導(dǎo)電與壓電雙重電活性的PVDF/PLCL/PEDOT人工神經(jīng)導(dǎo)管，該導(dǎo)管具有良好的自發(fā)電性能，可以通過促進雪旺細胞的成熟、成髓鞘以及分泌活性因子來促進缺損周圍神經(jīng)的再生。該工作從分子細胞學(xué)的角度闡明了電活性材料調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境促進周圍神經(jīng)修復(fù)再生的可能分子機制：通過上調(diào)巨噬細胞的鈣離子通道蛋白從而激活PI3K/AKT-Nrf2 抗炎信號通路，最終促進巨噬細胞的募集、M2 極化以及抗炎蛋白分泌，同時通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的旁分泌系統(tǒng)募集雪旺細胞并促進其成熟，進而間接促進周圍神經(jīng)修復(fù)。該工作以“Engineered PVDF/PLCL/PEDOT Dual Electroactive Nerve Conduit to Mediate Peripheral Nerve Regeneration by Modulating the Immune Microenvironment”為題發(fā)表在國際權(quán)威期刊Advanced Functional Materials上（Adv. Funct. Mater. 2024, 2400217），曹曉東教授和高會場副教授為該文的通訊作者，華南理工大學(xué)2021級碩士研究生王琪琪為文章第一作者。
圖1 PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境間接促進周圍神經(jīng)修復(fù)示意圖。
圖2. PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性復(fù)合薄膜的制備與性能表征
以PVDF、PLCL、PEDOT為材料，通過退火結(jié)晶以及相分離的制備工藝（圖2A）制備了PEDOT納米粒子分散均勻且具有微孔結(jié)構(gòu)的PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合薄膜（圖2B）。該復(fù)合薄膜具有良好的力學(xué)性能（圖2C），最大拉伸應(yīng)力可達15.4MPa，可伸長至681%以上（圖2D），能夠滿足在實際應(yīng)用中耐縫合以及抗扭結(jié)的力學(xué)需求。復(fù)合膜的電導(dǎo)率達到6.99×10-7S/cm，可促進雪旺細胞髓鞘化（圖2E），同時退火結(jié)晶的工藝保留了PVDF的β壓電結(jié)晶相（圖2F-G），保證了其復(fù)合膜具有壓電性能。
圖3 PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性材料的電學(xué)性能及其生物相容性
為了評估材料良好的導(dǎo)電性是否可以在體內(nèi)傳遞電信號，將復(fù)合膜卷曲成管狀，植入大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，然后收集復(fù)合肌肉動作電位（CMAP），發(fā)現(xiàn)電活性神經(jīng)導(dǎo)管可以在一定程度上傳遞神經(jīng)電信號，可植入初期作為“人工神經(jīng)”替代缺損神經(jīng)傳遞電信號（圖3B）。同時，當對PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜施加不同大小的機械力（0.5 N、2 N、4 N），復(fù)合膜發(fā)出不同電壓水平（1.44 V、1.84 V、3.2 V）（圖3D），表明電活性復(fù)合膜可以將機械能轉(zhuǎn)化為電能，當其在體內(nèi)接受到肌肉的擠壓時可以自發(fā)電刺激，從而刺激受損神經(jīng)再生。此外，PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜也具有良好的生物活性（圖3E-F）。
圖4. PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性材料促進周圍神經(jīng)修復(fù)的有效性驗證
首先通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗驗證了PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜對周圍神經(jīng)修復(fù)的有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜可顯著上調(diào)表達SOX-10、BDNF 和NGF，并下調(diào)表達的NCAM基因（圖4F），這表明雙重電活性復(fù)合膜能有效促進雪旺細胞的增殖，成熟、成髓鞘。進一步將其卷曲成管，植入大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，評價其坐骨神經(jīng)修復(fù)效果。結(jié)果表明，電活性神經(jīng)導(dǎo)管可以顯著促進髓鞘形成和軸突伸長，并促進再生神經(jīng)中新生血管成熟，修復(fù)效果與自體移植組相近（圖4A-E）。
圖5.PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性神經(jīng)導(dǎo)管促進缺損坐骨神經(jīng)信號傳導(dǎo)功能恢復(fù)及其支配的運動功能重建
本研究進一步通過Masson染色、SFI運動功能指數(shù)以及CMAP肌肉動作電位測定評估PVDF/PLCL/PEDOT電活性神經(jīng)導(dǎo)管促進缺損坐骨神經(jīng)信號傳導(dǎo)功能恢復(fù)及其支配的運動功能重建的效果。結(jié)果顯示，導(dǎo)管組可以抑制受損神經(jīng)所支配腓腸肌的萎縮，減少膠原沉積（圖5 A-B），所有實驗組在第1周時都已與空白對照組的SFI指數(shù)出現(xiàn)顯著差異，并且隨著時間的推移，顯著差異越來越大（圖5C）。CMAP的結(jié)果表明，導(dǎo)管組傳導(dǎo)電信號的功能與自體移植組相似（圖5D-F）。這些結(jié)果表明，電活性神經(jīng)導(dǎo)管在促進受損周圍神經(jīng)再生方面具有優(yōu)越的功效，其修復(fù)效果甚至可以與自體神經(jīng)移植物相媲美。值得一提的是，導(dǎo)管+超聲組在各個維度上修復(fù)效果都次于導(dǎo)管組，這是由于超聲形成的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)對組織修復(fù)產(chǎn)生不利影響。
圖6. 雙重電活性材料通過介導(dǎo)巨噬細胞行為影響雪旺細胞
眾所周知，當組織損傷發(fā)生時，免疫系統(tǒng)的反應(yīng)對組織修復(fù)至關(guān)重要。本研究通過巨噬細胞與雪旺細胞共培養(yǎng)實驗，探究了在電活性材料的介導(dǎo)下，巨噬細胞對雪旺細胞的影響。結(jié)果表明，電活性復(fù)合薄膜可以通過影響巨噬細胞的旁分泌系統(tǒng)對雪旺細胞產(chǎn)生良好的募集效果（圖6A），并且可以顯著促進雪旺細胞成熟、成髓鞘和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子（圖6B-C）。進一步探索雙重電活性復(fù)合薄膜對巨噬細胞的具體作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電活性材料具有募集巨噬細胞的能力，并且導(dǎo)電和壓電性具有協(xié)同促進巨噬細胞募集的效果（圖6D）。此外，其還有效地上調(diào)了抗炎因子（ARG-1、CD163）的表達，而下調(diào)了促炎因子（TNF-α，IL-1β）的表達（圖6E）。然而PLCL/PEDOT導(dǎo)電薄膜與PVDF/PLCL壓電薄膜并沒有顯示同樣的效果，說明導(dǎo)電性和壓電性在發(fā)揮抗炎效果的層面具有顯著的協(xié)同作用。這些結(jié)果表明雙重電活性材料具有調(diào)節(jié)巨噬細胞向 M2 抗炎表型的轉(zhuǎn)變的能力（圖6F）。
圖7. 雙重電活性復(fù)合薄膜激活了PI3K/AKT-Nrf2信號通路達到抗炎效果。
為了進一步確定電活性材料具有抗炎作用的分子機制，本研究通過RT-qPCR實驗，WB實驗以及免疫熒光染色實驗對可能的信號機制進行篩選 (圖7)。研究發(fā)現(xiàn)，電活性材料可以上調(diào)PI3K，AKT以及Nrf-2的基因表達，并上調(diào)p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平。并通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PVDF/PLCL/PEDOT組中核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2發(fā)生了核轉(zhuǎn)移。初步判定PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性復(fù)合膜具有通過促進PI3K和AKT的磷酸化，進而促進Nrf-2的核轉(zhuǎn)移來達到調(diào)控炎癥環(huán)境，上調(diào)抗炎蛋白表達而抑制促炎蛋白表達的效果。為了進一步驗證這一論點，在巨噬細胞培養(yǎng)過程中添加PI3K抑制劑LY294002，抑制PI3/AKT信號通路的激活，發(fā)現(xiàn)添加抑制劑后所有組別的PI3K均無上調(diào)，且其下游抗炎蛋白CD163和ARG-1的也未被上調(diào)，因此反向驗證了電活性復(fù)合膜確是通過激活PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境。
圖8. 體內(nèi)動物實驗證明PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性導(dǎo)管通過激活PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境
為了進一步確認電活性材料在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中仍然具有同樣的抗炎效果，本研究將PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜卷曲成神經(jīng)導(dǎo)管移入到大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，分別在第1周和第4周將在受損神經(jīng)組織的遠端、近端以及再生部分解剖離體，采用RT-qPCR檢測信號通路中關(guān)鍵基因（PI3K、AKT、HO-1）的表達。同時，對M1巨噬細胞標志蛋白CD86以及M2巨噬細胞標志蛋白CD206進行免疫熒光染色，表征在電活性神經(jīng)導(dǎo)管介導(dǎo)下?lián)p傷部位的炎癥環(huán)境。結(jié)果表明，在電活性神經(jīng)導(dǎo)管的介導(dǎo)下，PI3K、AKT和HO-1均顯著上調(diào)（圖8A），且CD206與CD86的免疫熒光染色結(jié)果與RT-qPCR的結(jié)果保持一致，表明電活性神經(jīng)導(dǎo)管在體內(nèi)仍然具有促進巨噬細胞向M2抗炎表型極化的效果（圖8C）。同時，為了反向驗證信號通路的準確性，在動物實驗中，設(shè)置了LY294002+導(dǎo)管組，對該組別的大鼠進行隔日腹腔注射PI3K抑制劑LY294002的處理，持續(xù)一月。發(fā)現(xiàn)該組別顯示出了較為顯著的炎癥反應(yīng)，與純導(dǎo)管組的結(jié)果相反，進一步確定了雙重電活性神經(jīng)導(dǎo)管是通過激活PI3K/AKT信號通路達到的抗炎效果（圖8B）。
圖9. 雙重電活性神經(jīng)導(dǎo)管通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境間接促進周圍神經(jīng)修復(fù)
體外細胞實驗已經(jīng)證明了在電活性材介導(dǎo)下巨噬細胞會分泌相關(guān)活性因子，從而影響雪旺細胞，間接促進周圍神經(jīng)修復(fù)，本研究在體內(nèi)動物實驗也進一步論證了這一論點。采用RT-qPCR實驗檢測與神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白（NGF、BDNF、NCAM）的表達，結(jié)果表明其表達與抗炎相關(guān)蛋白的表達趨勢相同，并且在具有PI3K抑制劑LY294002的組別中，NGF、BDNF的表達顯著下降且NCAM升高（圖9A）。為了更加直觀和全面的分析本研究中所有RT-qPCR基因檢測結(jié)果，將所有組別在兩個時間節(jié)點（第1周，第4周）上涉及到的所有基因表達水平進行了聚類熱圖分析（圖9B）。導(dǎo)管組組不管是在哪個時間節(jié)點，都能激活PI3K/AKT信號通路，促進HO-1的表達來調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境，并上調(diào)抗炎因子的表達而抑制促炎因子的表達，最終促進周圍神經(jīng)修復(fù)。
圖10. 電活性材料對免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)對受損坐骨神經(jīng)的修復(fù)具有重要意義
為了驗證炎癥信號通路的阻斷是否最終會影響其運動功能的恢復(fù)，在動物實驗中，本工作還設(shè)置了導(dǎo)管+LY294002組。結(jié)果顯示，不同組對腓腸肌萎縮的抑制程度如下：空白組<導(dǎo)管+LY294002組<導(dǎo)管組（圖10A-B），表明雖然電活性神經(jīng)導(dǎo)管可顯著抑制腓腸肌萎縮，但當炎癥信號通路被阻斷時，電活性神經(jīng)導(dǎo)管對腓腸肌的抑制作用大大減弱。此外，還對再生神經(jīng)的縱切面進行了H&E染色（圖10C），發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管組在第28天實現(xiàn)了橫斷神經(jīng)的完全連接，而導(dǎo)管+LY294002組尚未實現(xiàn)損傷神經(jīng)的遠端與近端連接。SFI運動功能指數(shù)的測試結(jié)果（圖10D），甲苯胺藍染色（圖10E）和透射電鏡觀察再生神經(jīng)的軸突形成和髓鞘再生結(jié)果（圖10F）以及CD31免疫組化染色結(jié)果（圖10G）都顯示導(dǎo)管組具有較好的促坐骨神經(jīng)再生的作用。然而，當PI3K/AKT-Nrf2信號通路被阻斷時，其修復(fù)效果大打折扣，并且隨著時間的延長，這種現(xiàn)象變得更加突出。從上述結(jié)果不難得出，免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)對周圍神經(jīng)的修復(fù)至關(guān)重要，當免疫微環(huán)境調(diào)控途徑被阻斷時，其促進神經(jīng)修復(fù)的作用大大減弱。
本研究證明了電活性材料在調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和周圍神經(jīng)修復(fù)中的有效性，同時突出了免疫調(diào)節(jié)在周圍神經(jīng)修復(fù)中的關(guān)鍵作用，為電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管應(yīng)用于臨床周圍神經(jīng)修復(fù)提供了理論依據(jù)。
該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金（31971261、52272276、52073103）、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（2023A1515012232、2020A1515010668）等經(jīng)費資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202400217
