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  為了實(shí)現(xiàn)預(yù)防、診斷、治療等藥效功能，生物大分子藥物往往需要穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)。因此，生物藥物胞內(nèi)遞送是生物藥物面臨的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。由于光介導(dǎo)的胞內(nèi)遞送方法具有較好的通用性和調(diào)控性，適用于各類(lèi)細(xì)胞和各種生物藥物的遞送，尤其是在體外或離體處理的情況，因此受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

  黃超伯/熊燃華課題組長(zhǎng)期致力于功能性生物大分子胞內(nèi)遞送研究，利用光熱納米顆粒（NPs）富集于細(xì)胞表面進(jìn)行光穿孔，光熱NPs產(chǎn)生的瞬時(shí)光熱效應(yīng)可以將功能性生物大分子溫和地遞送至活細(xì)胞中，適用于多種細(xì)胞類(lèi)型和生物大分子。然而，該光穿孔技術(shù)依賴于細(xì)胞與光熱NPs的直接接觸，這在臨床應(yīng)用中，特別是在癌癥患者自體免疫T細(xì)胞功能化改造過(guò)程中，面臨安全性和監(jiān)管的諸多挑戰(zhàn)。為此，研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地提出了一種基于光熱靜電紡納米纖維（PEN）介導(dǎo)的光穿孔技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)將光熱NPs嵌入靜電紡納米纖維中，作為細(xì)胞培養(yǎng)的基底，利用光熱效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞膜透化，進(jìn)而有效遞送生物大分子至各種細(xì)胞類(lèi)型。與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)避免了細(xì)胞與NPs的直接接觸，從而顯著降低了安全性和監(jiān)管風(fēng)險(xiǎn)。與常用的物理轉(zhuǎn)染方法——電穿孔相比，PEN光穿孔對(duì)細(xì)胞的損傷更小，能夠獲得更高質(zhì)量的工程化改造細(xì)胞，展現(xiàn)出更強(qiáng)的臨床治療潛力（Nat. Nanotechnol. 2021, 16, 1281、Adv. Mater. 2021, 33, 2008379、Nat. Commun. 2022, 13, 1996）。

圖1. PEN光穿孔用于胞內(nèi)遞送的詳細(xì)步驟。（1）靜電紡絲制備包載光熱納米顆粒的PEN納米纖維基底。（2）PEN基底和細(xì)胞共培養(yǎng)。（3）PEN光穿孔激光輻射平臺(tái)。（4）利用模型大分子優(yōu)化PEN光穿孔參數(shù)。（5）采用優(yōu)化的PEN光穿孔方案，將功能大分子遞送至各種類(lèi)型細(xì)胞。（6）體外和體內(nèi)驗(yàn)證PEN光穿孔工程化改造CAR-T細(xì)胞的治療效果。

圖2. PEN 光穿孔參數(shù)優(yōu)化用于 HeLa貼壁細(xì)胞和 Jurkat 懸浮細(xì)胞的遞送。（a）在有和無(wú)膠原涂層的 PEN 基底上生長(zhǎng)的 Calcein AM 標(biāo)記的 HeLa 細(xì)胞的共聚焦圖像。（b）HeLa 細(xì)胞在不同激光能量和光熱NPs 濃度下的 RD10遞送效率和細(xì)胞活性。（c）深紅色熒光 CellMask 標(biāo)記的 Jurkat 細(xì)胞在香豆素6標(biāo)記的 PEN基底上的共聚焦圖像。（d）Jurkat 細(xì)胞在不同激光能量、光熱NPs 濃度、和重復(fù)激光照射下的FD10遞送效率和細(xì)胞活性。

圖3. PEN 光穿孔應(yīng)用于功能大分子siRNA或CRISPR-Cas9 RNPs的胞內(nèi)遞送研究。（a）共聚焦顯微鏡顯示了使用 1 wt% 光熱NPs 和 0.08 J cm^?2 激光能量進(jìn)行 PEN 光穿孔處理的對(duì)照組和 siGFP胞內(nèi)遞送的 H1299 細(xì)胞eGFP 的表達(dá)。（b,c）不同 siGFP 濃度或在低濃度 0.5 μM siGFP下重復(fù) PEN 光孔化處理時(shí)，H1299 細(xì)胞eGFP 表達(dá)的 MFI 和 eGFP 敲低效率。（d）共聚焦顯微鏡顯示了光穿孔將CRISPR-Cas9 RNPs遞送到H1299細(xì)胞以敲除GFP表達(dá)。（e,f）不同 RNP 濃度或在低濃度 0.5 μM RNP下重復(fù) PEN 光孔化處理時(shí)，H1299 細(xì)胞eGFP 表達(dá)的 MFI 和 eGFP 敲除效率。

圖4. PEN光穿孔用于人T細(xì)胞高效安全的生物大分子胞內(nèi)遞送及其腫瘤細(xì)胞殺傷功能。（a）PEN光穿孔方法遞送小干擾核酸siPD1到T細(xì)胞以抑制PD1蛋白表達(dá)。（b）使用優(yōu)化的 PEN 光孔化參數(shù)（5 wt% 光熱NP濃度，0.16 J cm^?2 激光能量和 NaOH 水解的 PENs）時(shí)，siPD1 濃度變化對(duì)人類(lèi) T 細(xì)胞中 PD1 敲低效率的影響。（c）靜脈注射CAR-T細(xì)胞(陰性對(duì)照)、PEN光穿孔處理的CAR T 細(xì)胞（攜帶 siPD1，實(shí)驗(yàn)組）和與PD1 抗體聯(lián)合使用的 CAR T 細(xì)胞（陽(yáng)性對(duì)照）的腫瘤大小隨時(shí)間變化。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41596-024-01115-7

  實(shí)驗(yàn)室主頁(yè)：https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent