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  先天性缺陷、外傷、腫瘤、原發(fā)性肌病、代謝性疾病等各種原因造成的骨骼肌缺損和功能喪失是臨床常見(jiàn)的病例。傳統(tǒng)治療方法主要是肌皮瓣移植，但由于可利用的自體肌肉來(lái)源有限，對(duì)供區(qū)損傷較大給病人帶來(lái)新傷害；而異體移植供體同樣面臨來(lái)源有限，且存在免疫排斥等問(wèn)題，使其應(yīng)用受到限制。組織工程方法是將體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的高濃度功能相關(guān)組織細(xì)胞種植在一種生物相容性好、同時(shí)能夠被機(jī)體降解的生物材料上，即組織工程支架材料，形成材料-細(xì)胞復(fù)合物，將此復(fù)合物移植到所需部位，在機(jī)體內(nèi)細(xì)胞繼續(xù)增殖，而支架材料逐漸被降解、吸收，從而達(dá)到修復(fù)受損組織或重建功能的目的�；诮M織工程方法體外構(gòu)建血管化肌肉微組織，有望解決骨骼肌組織缺損和功能喪失等問(wèn)題。

  華僑大學(xué)陳愛(ài)政教授課題組和哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授課題組基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）多孔微球及聚乙二醇（PEG）中空短棒狀微纖維，分別通過(guò)成肌細(xì)胞（C2C12）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的負(fù)載成功構(gòu)建血管化肌肉微組織，并通過(guò)共同注射的方式研究該肌肉微組織在血管化肌組織原位方面的應(yīng)用（圖1）。

圖1. 研究示意圖。

  首先，利用微流控技術(shù)制備了PLGA大多孔微球（PLGA PMs）并體外構(gòu)建微組織（圖2）。通過(guò)微流控技術(shù)制備的PLGA PMs平均粒徑為395 μm，擁有開(kāi)放且相互貫通的孔洞，孔徑為10-60 μm。在PLGA PMs中接種C2C12，通過(guò)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法探索細(xì)胞組織聚集體的形成條件及肌肉微組織的形成過(guò)程，構(gòu)建3D肌肉微組織模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)7天后，分散性良好的微球之間開(kāi)始聚集，并在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中形成組織團(tuán)塊。

圖2. 基于PLGA PMs體外構(gòu)建肌肉微組織

  然后，通過(guò)微流控技術(shù)和光聚合技術(shù)相結(jié)合得到負(fù)載HUVECs的中空短棒狀血管微組織。以丙烯酸-聚乙二醇-琥珀酰亞胺基羧甲基酯（Acr-PEG-NHS）為原料，以共價(jià)修飾的方法得到了細(xì)胞活性好的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-PEG-Acr（RGD-PEG-Acr）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-PEG-Acr（VEGF-PEG-Acr），并研究了修飾作用下材料的生物安全性及對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的調(diào)控作用。另外，采用復(fù)乳法制備載堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的PLGA納米粒（NPs），并復(fù)合到PEG水凝膠網(wǎng)絡(luò)中（圖3）。利用微流控技術(shù)和UV引發(fā)光聚合技術(shù)制備了中空短棒狀微纖維，微纖維外徑約為350 μm、內(nèi)徑約為110 μm、厚度約為120 μm、長(zhǎng)度約為1.5 mm，DAPI染色結(jié)果表明體外培養(yǎng)5天后，支架仍具有良好的中空結(jié)構(gòu)及機(jī)械強(qiáng)度，HUVECs呈管狀分布；且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）方法分析結(jié)果顯示促血管生成素（Ang-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和酪氨酸激酶-2（Tie-2）中特定信號(hào)傳導(dǎo)部分的表達(dá)水平均有顯著性提升，表明了體外血管形成的趨勢(shì)。

圖3. 基于PEG HMs體外構(gòu)建血管微組織

  接著，為了進(jìn)一步研究共混后的肌肉微組織及血管微組織在體內(nèi)的作用情況，在已經(jīng)形成的肌缺損部位注射入混合肌肉微組織、血管微組織作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別注射生理鹽水、乙醇、空白支架、混合細(xì)胞懸液為對(duì)照組，以造模后不處理作為空白對(duì)照組，觀察SCID大體積肌缺損的肌肉修復(fù)和組織再生情況（圖4）。通過(guò)HE染色觀察注射后組織的水腫、纖維化、及肌細(xì)胞再生的情況。根據(jù)HE結(jié)果分析可以看出術(shù)后3 d內(nèi)屬肌組織的破壞、炎癥階段，3 d - 14 d為肌組織修復(fù)階段，注射入機(jī)體的PLGA PMs由于含有大量成熟的C2C12細(xì)胞，且體外實(shí)驗(yàn)證明，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下C2C12-PLGA PMs能夠出現(xiàn)自由聚集，這些聚集有助于微載體中的C2C12根據(jù)機(jī)體需要和自身的成肌細(xì)胞組裝形成中心排列的核進(jìn)而形成肌纖維。14 d - 28 d為肌組織重塑階段，對(duì)于實(shí)驗(yàn)組來(lái)說(shuō)，成纖維細(xì)胞的增生為合成結(jié)締組織、為再生組織提供穩(wěn)定的微環(huán)境起到重要作用，肌組織的修復(fù)基本完成。

圖4. SCID右后腿脛前肌注射、肌肉微組織+血管微組織、乙醇、空白支架、生理鹽水、細(xì)胞混懸液及空白對(duì)照組不同時(shí)間后HE染色分析

  通過(guò)Masson染色觀察細(xì)胞在組織內(nèi)部的作用及肌肉的損傷、炎癥的修復(fù)及纖維化情況（圖5）。Masson染色觀察細(xì)胞在組織內(nèi)部的作用及肌肉的損傷、炎癥的修復(fù)及纖維化情況結(jié)果和HE染色結(jié)果大體一致，成纖維細(xì)胞的大量增殖過(guò)程導(dǎo)致了膠原纖維的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后28 d時(shí)呈現(xiàn)出形狀規(guī)則、紅色均勻分布的肌組織形態(tài)，其它對(duì)照組均出現(xiàn)了不同程度的膠原纖維的過(guò)度再生和沉積，最終導(dǎo)致了瘢痕的形成，影響了骨骼肌組織功能的重建。

圖5. SCID右后腿脛前肌注射肌肉微組織+血管微組織、乙醇、空白支架、生理鹽水、細(xì)胞混懸液及空白對(duì)照組不同時(shí)間后的Masson染色分析

  最后，利用免疫熒光組織學(xué)染色觀察組織內(nèi)部不同組別血管生成相關(guān)因子CD31、VE-Cad的表達(dá)情況及肌纖維形成相關(guān)蛋白Desmin、MyoD的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明，基于微流體控技術(shù)制備的大多孔高分子微球、中空短棒裝微纖維作為微載體在構(gòu)建血管化組織用于組織再生的研究具有潛在的應(yīng)用前景。

  以上相關(guān)成果以“Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration”為題，近期在線發(fā)表于《Biomaterials》。論文通訊作者為華僑大學(xué)陳愛(ài)政教授和哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授，論文第一作者為華僑大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)2020屆博士畢業(yè)生王穎。華僑大學(xué)王士斌教授、Ranjith Kumar Kankala副教授、張建庭講師、2020屆博士畢業(yè)唐含笑、2020屆碩士畢業(yè)蔡園園、復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院朱鎧副教授和福建醫(yī)科大學(xué)楊達(dá)云副教授為論文的共同作者。

  華僑大學(xué)部分的研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金（81971734，32071323）、國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目（U1605225）以及福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目的資助。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121072

作者簡(jiǎn)介：

陳愛(ài)政：博士、教授、博士生導(dǎo)師。

福建省優(yōu)秀教師，入選國(guó)家百千萬(wàn)人才工程、被授予“有突出貢獻(xiàn)中青年專(zhuān)家”榮譽(yù)稱號(hào)。目前擔(dān)任中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)理事、中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)復(fù)合材料分會(huì)秘書(shū)長(zhǎng)、中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)青年委員會(huì)委員、華僑大學(xué)生物材料與組織工程研究所所長(zhǎng)、福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人、福建省生物材料化工博士生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)帶頭人。主持國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間國(guó)際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)等國(guó)家級(jí)課題8項(xiàng)。主要從事超臨界流體技術(shù)及生物材料與組織工程領(lǐng)域的研究，已在AM、AFM、Small、JCR、CEJ、AHM、Biomaterials、Biofabrication等期刊發(fā)表SCI收錄論文100余篇，獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利10余項(xiàng)。

課題組網(wǎng)頁(yè)：https://www.x-mol.com/groups/hqubiomat 

Y. Shrike Zhang：博士，美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院助理教授，2013年于Georgia Institute of Technology生物醫(yī)學(xué)工程系取得博士學(xué)位。研究領(lǐng)域包括生物打印及器官芯片的平臺(tái)搭建與應(yīng)用研究，在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表研究論文及綜述240余篇，包括以第一或通訊作者發(fā)表的PNAS、Science、Nat. Rev. Mater.、Nat. Rev. Nephrol.、Nat. Commun.、Matter、Adv. Mater.、ACS Nano、Angew. Chem. Int. Ed.、Biomaterials 等，其中超過(guò)45篇封面文章；研究成果曾被BBC、Fox News、The Boston Globe/STAT News、Science Daily、Technology Networks、IEEE Spectrum、C&EN、《科技日?qǐng)?bào)》等報(bào)道。擔(dān)任20余本雜志的主編、副主編或編委，曾獲得多種國(guó)際和地區(qū)性獎(jiǎng)項(xiàng)40余項(xiàng)。

課題組網(wǎng)頁(yè)：https://shrikezhang.com/