由于椎間盤退變（IVDD）引起的下腰背疼痛已成為發(fā)病率最高的疼痛性疾病之一，給社會經(jīng)濟(jì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。作為椎間盤（IVD）的重要結(jié)構(gòu)，髓核組織（NP）與纖維環(huán)（AF）和軟骨終板（CEP）一起維持著脊柱的穩(wěn)定性和生理功能。髓核細(xì)胞密度降低、基質(zhì)金屬蛋白酶等相關(guān)降解因子的過度表達(dá)是IVDD的主要表現(xiàn)，也是細(xì)胞外基質(zhì)中II型膠原（COL II）和糖胺聚糖（ACAN）的密度下降進(jìn)而無法維持椎間盤正常生理功能的原因。當(dāng)前臨床治療所使用的物理治療、脊柱融合術(shù)或椎間盤切除術(shù)雖然取得一定的效果，但是并不能實現(xiàn)髓核組織再生，從根本上逆轉(zhuǎn)IVDD。通過合適的組織工程材料向退變髓核組織遞送髓核細(xì)胞或干細(xì)胞是提高髓核組織細(xì)胞密度，恢復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)合成的直接手段，近年來也被廣泛研究。然而，遞送過程中細(xì)胞泄露導(dǎo)致的異位成骨、體外擴(kuò)增培養(yǎng)髓核細(xì)胞存在去分化的風(fēng)險、干細(xì)胞的活性和分化能力會在遞送后受到損害等問題在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。研究表明存在于健康和退行性 IVD 中的干/祖細(xì)胞具有分化成髓核組織的潛能，是替代外源性細(xì)胞的理想細(xì)胞源。募集和促進(jìn)這些細(xì)胞向髓核分化需要多種生物活性因子時序性參與，但目前仍缺乏既滿足合適的活性因子釋放動力學(xué)，又滿足有效募集細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞生長浸潤和向髓核分化的支架材料。
針對以上問題，華南理工大學(xué)國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心曹曉東教授團(tuán)隊報道了一種順序釋放生物活性因子的可注射微孔性微凝膠組裝體支架MA-TNS（圖1），它能夠促進(jìn)細(xì)胞的浸潤和長入，并通過快速釋放基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1a（SDF-1α）募集內(nèi)源性干細(xì)胞，隨后持續(xù)釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-b1）促進(jìn)干細(xì)胞向髓核分化，最終實現(xiàn)大鼠退變髓核再生和抑制食蟹猴腰椎間盤的進(jìn)一步退變。該工作以“Injectable and Microporous Microgel Assembly with Sequential Bioactive Factor Release for the Endogenous Repair of Nucleus Pulposus”為題發(fā)表在國際權(quán)威期刊Advanced Functional Materials上（Adv. Funct. Mater. 2024, 2315592）上，曹曉東教授和博士后馮琦為該文的通訊作者，華南理工大學(xué)博士研究生羅惠彤為文章第一作者。
圖1 順序釋放生物活性因子的可注射微凝膠組裝體的制備及髓核修復(fù)示意圖
為了實現(xiàn)SDF-1α和TGF-b1的順序釋放，研究團(tuán)隊首先制備硫酸軟骨素/明膠復(fù)合納米顆粒（CGNPs）負(fù)載生長因子TGF-β1，獲得納米粒子TGF@CGNPs（圖1A）。隨后，TGF@CGNPs和趨化因子SDF-1α共同封裝到微凝膠中。該雙活性因子負(fù)載的微凝膠（MG-TNS）以雙鍵修飾的明膠（GelMA）以及雙鍵和苯硼酸雙修飾的透明質(zhì)酸（HAMA-PBA）為基體材料，通過乳液法和光交聯(lián)的方式獲得（圖1B）。微凝膠通過表面上的苯硼酸基團(tuán)和作為組裝劑的多巴胺修飾的透明質(zhì)酸（HADA）發(fā)生苯硼酸酯鍵，形成具有連通微孔的微凝膠組裝體支架（MA-TNS）。
納米顆粒通過去溶劑化法獲得，并以靜電相互作用將TGF-b1負(fù)載于納米顆粒上。TGF@CGNPs平均粒徑為193.7 nm（圖2）。
圖2 負(fù)載TGF-β1的納米顆粒的制備和表征
乳液法制備獲得的雙活性因子負(fù)載微凝膠平均粒徑為132.6±20.9 μm，SDF-1α和TGF@CGNPs可均勻分散在微凝膠中（圖3）。經(jīng)苯硼酸酯反應(yīng)獲得的微凝膠組裝體MA-TNS具有連通的微孔結(jié)構(gòu)。在椎間盤自然載荷頻率范圍內(nèi)（25-35 rad s-1）保持穩(wěn)定的凝膠狀特性。MA-TNS還具有良好的可注射、自愈合特性，能滿足髓核修復(fù)的基本需求。此外，在活性因子釋放方面，該組裝體可實現(xiàn)SDF-1α在前期快速釋放（7天后累積釋放量為62.4%），TGF-β1隨后持續(xù)性釋放（28天累積釋放量為46.5%），這有利于快速募集細(xì)胞和長期誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。
圖3 順序釋放生物活性因子的微凝膠組裝體MA-TNS的制備及理化性能表征
MA-TNS通過釋放趨化因子具有良好的募集干細(xì)胞的能力。微凝膠組裝體具有良好的細(xì)胞相容性，能夠支持干細(xì)胞增殖。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞生長進(jìn)入微凝膠組裝體內(nèi)部，5天長入深度約為300 μm，且封裝在微凝膠組裝體中的生物活性因子對浸潤深度沒有顯著影響。相比之下，相同組分制備的塊狀水凝膠會明顯阻礙細(xì)胞浸潤行為，細(xì)胞長入深度不隨培養(yǎng)時間變化。這些發(fā)現(xiàn)表明具有連通微孔結(jié)構(gòu)的微凝膠組裝體有利于細(xì)胞浸潤（圖4）。
圖4 微凝膠組裝體募集干細(xì)胞以及促進(jìn)細(xì)胞浸潤長入的能力表征
在體外分化實驗中（圖5），培養(yǎng)7天和21天后，與其余組相比，含有TGF-β1的組中軟骨標(biāo)志性基SOX9、ACAN和COL II的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且這種上調(diào)效果隨時間推移而增強(qiáng)。免疫熒光染色進(jìn)一步表明，微凝膠組裝體釋放的TGF-β1顯著促進(jìn)了ACAN和COL II的表達(dá)。與TGF-β1和SDF-1α同時從組裝體中快速釋放的組別（MA-TS）相比，在納米顆粒的幫助下，TGF-β1從微凝膠組裝體（MATNS）中持續(xù)釋放，能夠在細(xì)胞培養(yǎng)過程中保持生物活性和有效濃度，使軟骨標(biāo)志性基因和蛋白高表達(dá)。因此，微凝膠組裝體MA-TNS能夠確保內(nèi)源干細(xì)胞長期有效分化。
圖5 順序釋放生物活性因子的微凝膠組裝體體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化能力表征
為了評價 MA-TNS 在體內(nèi)的治療效果，研究團(tuán)隊采用針刺法在大鼠尾椎建立IVDD模型，并注射材料，并于術(shù)后5周和10周進(jìn)行影像學(xué)和組織學(xué)分析（圖6）。與其他實驗組相比，髓核組織能維持較高的水合狀態(tài)，結(jié)構(gòu)較完整，組織界限清晰。免疫組化表明MA-TNS組髓核組織中COL II和ACAN含量明顯較多（圖7），說明雙活性因子順序釋放微凝膠組裝體能夠顯著改善髓核細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡，實現(xiàn)髓核再生。
圖6 微凝膠組裝體修復(fù)大鼠尾椎效果表征
圖7 微凝膠組裝體修復(fù)大鼠尾椎免疫組化表征
與大鼠等小型嚙齒類動物相比，食蟹猴的椎間盤在生物學(xué)和生物力學(xué)方面與人類椎間盤更為相近。研究團(tuán)隊進(jìn)一步評估了材料體系對食蟹猴腰椎間盤退變的療效（圖7）。術(shù)后6周和25周結(jié)果表明MA-TNS這一雙活性因子順序釋放微凝膠組裝體能夠抑制食蟹猴椎間盤進(jìn)一步退變。本研究為組織工程退變椎間盤的功能再生提供了新思路，有望進(jìn)一步應(yīng)用于椎間盤退變的臨床治療中。
圖8 微凝膠組裝體治療食蟹猴腰椎間盤退變
該研究工作得到國家自然科學(xué)基金委面上項目（52073103、 52272276、51873069和52203164）以及聯(lián)合基金項目（U22A20162）等經(jīng)費(fèi)資助。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202315592
