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安中醫(yī)王琪/程志非/桂雙英團(tuán)隊(duì) ACS Nano：基于工程化細(xì)胞外囊泡的納米制劑協(xié)調(diào)神經(jīng)炎癥和免疫穩(wěn)態(tài)以增強(qiáng)帕金森病治療
2024-08-22  來源：高分子科技

  帕金森病(PD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，以多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性損傷和黑質(zhì)(SN) α-突觸核蛋白(α-syn)異常積累為主要特征。過度激活的腦免疫微環(huán)境是PD快速進(jìn)展的關(guān)鍵因素，由腦內(nèi)常駐小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥和腦外周免疫細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)共同推動(dòng)。為解決腦內(nèi)過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥問題，目前已經(jīng)提出了許多策略，包括激活下游的抗炎信號(hào)通路如NF-κB或利用納米酶的生物催化。然而，值得注意的是，如果不能及時(shí)預(yù)防神經(jīng)炎癥產(chǎn)生的源頭或腦外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)引起的免疫惡化，很難達(dá)到治療PD的目的。因此，需要綜合治療的方法以橋接腦內(nèi)部和外部以重塑PD過度激活的免疫微環(huán)境。



  近日，安徽中醫(yī)藥大學(xué)王琪/程志非/桂雙英研究團(tuán)隊(duì)提出一種創(chuàng)新的PD內(nèi)外綜合治療策略：從“內(nèi)”抑制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)炎癥的源頭，從“外”阻斷腦外周免疫細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)以恢復(fù)異常的免疫紊亂。該團(tuán)隊(duì)利用過表達(dá)趨化因子受體CCR2的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（MSCCCR2 EVs），通過將其涂覆在負(fù)載中藥活性成分二氫丹參酮I的納米載體(MSeN-DT)上，成功制備出工程化細(xì)胞外囊泡納米制劑（EVN）。MSCCCR2EVs (EVN的外殼)由于高表達(dá)CCR2在黑質(zhì)中顯示出對(duì)特定趨化因子CCL2的歸巢，并有效阻斷CCR2-CCL2信號(hào)軸，從而阻斷腦外周免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外MSeN-DT (EVN的核心)可以通過促進(jìn)Nrf2?GPX4通路阻斷炎癥源以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的鐵死亡。總的來說，這項(xiàng)研究結(jié)果表明，EVN提供了一種集趨化性和靶向性，減輕炎癥和調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)為一體的綜合治療PD方法。相關(guān)工作以”Engineered Extracellular Vesicle-Based Nanoformulations That Coordinate Neuroinflammation and Immune Homeostasis, Enhancing Parkinson’s Disease Therapy”為題發(fā)表于ACS Nano 上（DOI: 10.1021/acsnano.4c04674）。安徽中醫(yī)藥大學(xué)王琪研究員、程志非研究員和桂雙英教授為共同通訊作者，碩士研究生張川為第一作者。


圖1. 過表達(dá)CCR2的工程細(xì)胞外囊泡納米制劑的制備及其對(duì)PD治療的調(diào)控示意圖



圖2. EVN體外抑制腦外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的能力評(píng)估通過流式細(xì)胞儀分析(A)RAW264.7和(B)中性粒細(xì)胞與H2O2預(yù)處理的BV2細(xì)胞(加或不加CCL2)共培養(yǎng)條件下的遷移情況

  在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將RAW264.7或中性粒細(xì)胞(主要外周免疫細(xì)胞)置于上腔，將不同條件下的小膠質(zhì)細(xì)胞系(BV2細(xì)胞)置于下腔進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與MSCCCR2 EVs和MSeN-DT組相比，EVN組RAW264.7細(xì)胞的遷移率明顯受到抑制，遷移率為16.47%(圖2A)。此外，中性粒細(xì)胞向下腔的遷移也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，表明對(duì)浸潤(rùn)有抑制作用(圖2B)。


圖3. EVN調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化的藥理學(xué)機(jī)制。(A) Nrf2-GPX4信號(hào)通路示意圖。(B)不同處理后BV2細(xì)胞Nrf2和GPX4表達(dá)的WB分析。(C, D)各組Nrf2和GPX4的相對(duì)表達(dá)量，其中對(duì)照組的表達(dá)量表示為1 (I:對(duì)照組，II:模型，III: MSCCCR2 EVs, IV: MSeN-DT, V: EVN, VI: tBHQ, VII: ML385, n = 5)。(E)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fe2+熒光探針染色不同條件下BV2細(xì)胞內(nèi)Fe2含量的研究(I:對(duì)照組，II:模型，III: MSCCCR2 EVs, IV: MSeN-DT, V: EVN, VI:(F) JC-1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理后BV2細(xì)胞線粒體膜電位(I:對(duì)照，II:模型，III: MSCCCR2 EVs, IV: MSeN-DT, V: EVN, n = 3)。(G)不同處理后BV2線粒體代表性生物透射電鏡圖像(紅箭頭:線粒體脊減少，綠箭頭:線粒體脊增加)


  基于之前的說法，他們假設(shè)所遞送的DT可以有效激活Nrf2，通過Nrf2?GPX4途徑消除上游ROS的產(chǎn)生，抑制鐵下沉(圖3A)。抑制鐵凋亡和阻斷上游ROS生成的一個(gè)重要方面是通過EVN傳遞的DT完全激活Nrf2表達(dá)。本研究以Nrf2激動(dòng)劑叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)和Nrf2抑制劑ML385分別作為陽性和陰性對(duì)照。如圖3B、C所示，EVN組通過抑制Keap1蛋白的表達(dá)，有效促進(jìn)Nrf2的胞內(nèi)釋放。在PD患者的大腦中，細(xì)胞中GPX4的失活或減少導(dǎo)致脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中的鐵死亡如圖3B、D所示，與對(duì)照組相比，MSeN-DT和EVN上調(diào)Nrf2和GPX4的表達(dá)。Fe2+水平升高是PD患者鐵代謝異常的直接原因。


  線粒體膜電位的波動(dòng)是鐵死亡的常見標(biāo)志。使用流式細(xì)胞術(shù)通過JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位的變化，這是一種反映線粒體膜電位的測(cè)定方法如圖3F所示，對(duì)照組H2O2處理后，聚集/單體熒光比值從3.40下降到1.40，表明線粒體因PD相關(guān)炎癥損傷。經(jīng)MSCCCR2 EVs、MSeN-DT和EVN處理后，JC-1的聚合/單體熒光比分別恢復(fù)到2.02、2.37和2.95。提示EVN能有效恢復(fù)線粒體功能，抑制鐵死亡。透射電鏡進(jìn)一步觀察BV2細(xì)胞線粒體病理，如圖3G所示，形態(tài)學(xué)變化反映了鐵死亡程度。模型組大鼠線粒體膜腫脹破裂，線粒體嵴減少或消失。EVN治療后，顯著減少腫脹的線粒體，表明有效抑制與鐵死亡相關(guān)的線粒體損傷。因此，這些結(jié)果共同表明，EVN通過調(diào)節(jié)Nrf2和GPX4的表達(dá)至正常水平，從而減輕神經(jīng)炎癥，從而阻止鐵死亡的發(fā)生。


圖4. EVN在體內(nèi)抑制神經(jīng)炎癥的能力評(píng)估。(A)不同處理小鼠SN中Iba-1(紅色)的代表性免疫熒光圖像及相應(yīng)的定量分析，其中假手術(shù)組Iba-1的相對(duì)MFI為1 (n = 3)。(B)流式細(xì)胞術(shù)研究不同處理小鼠中腦小膠質(zhì)細(xì)胞表型及不同條件下小膠質(zhì)細(xì)胞CD86和CD206的相應(yīng)百分比(n = 3)。


  為了證實(shí)PD患者受干擾的免疫系統(tǒng)的恢復(fù)，研究了EVN在體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥和免疫穩(wěn)態(tài)的能力。PD神經(jīng)炎癥指標(biāo)Iba-1在PBS組呈升高趨勢(shì)，而在EVN治療組呈下降趨勢(shì)(圖4A)。定量分析還表明，EVN能顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了PD小鼠SN中小膠質(zhì)細(xì)胞從M1表型向M2表型的轉(zhuǎn)變。EVN處理組與PBS組相比，M1特異性CD86+小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)水平顯著降低，M2特異性CD206+小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)水平上調(diào)(圖4B)。


圖5. EVN阻止腦外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的體內(nèi)治療機(jī)制(A?F)不同處理小鼠腦內(nèi)MPO、DA、8-OHG、CCL2的相對(duì)定量(其中假手術(shù)組的相對(duì)表達(dá)量記為1,n = 5)。(H)各組腦內(nèi)巨噬細(xì)胞(CD45high、CD11b+)的流式細(xì)胞術(shù)分析和(I)定量分析。


  他們將8-羥基鳥苷(8-OHG)的表達(dá)水平作為氧化損傷的標(biāo)志物來評(píng)估EVN減輕PD腦氧化損傷的能力(圖5A)。與模型組相比，MSCCCR2 EVs、MSeN-DT和EVN治療組8-OHG表達(dá)水平顯著降低，達(dá)到與假手術(shù)組相似的水平。這說明EVN具有較強(qiáng)的活性氧清除能力。多巴胺(DA)濃度是臨床評(píng)價(jià)PD治療效果的標(biāo)準(zhǔn)，如圖5B所示，他們還對(duì)這些小鼠紋狀體中DA的濃度進(jìn)行了評(píng)估，以進(jìn)一步證明EVN的治療作用。與PBS組比較，MSCCCR2 EVs、MSeN-DT和EVN均使小鼠DA濃度升高。特別是，EVN處理小鼠的DA濃度恢復(fù)到與假手術(shù)組相似的水平。綜上所述，EVN通過激活Nrf2?GPX4通路，有效抑制腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥。進(jìn)一步研究了EVN在體內(nèi)抑制外周細(xì)胞浸潤(rùn)的能力。


  炎癥趨化因子CCL2是PD腦損傷中心炎癥細(xì)胞歸巢的主要介質(zhì)之一(圖5C)。結(jié)果顯示，EVN治療顯著降低PD腦中趨化因子CCL2的水平，從而可能減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的過度募集和積累導(dǎo)致PD免疫微環(huán)境過度激活，增加小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥。髓過氧化物酶(MPO)是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的生物標(biāo)志物，被用來評(píng)估EVN對(duì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的潛在減少。EVN處理后，腦內(nèi)MPO含量有效降低，與假手術(shù)組相當(dāng)(圖5D)。我們還研究了不同小鼠尾注射后24 h巨噬細(xì)胞(CD45high CD11b+)的浸潤(rùn)情況(圖5E、5F)。EVN處理的PD小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞較少(與假手術(shù)組幾乎相同)。這些數(shù)據(jù)表明，EVN處理可以顯著減少外周巨噬細(xì)胞向大腦的浸潤(rùn)。綜上所述，CCR2高表達(dá)的EVN外殼通過切斷CCR2- CCL2軸抑制外周炎癥細(xì)胞募集，從而促進(jìn)PD腦內(nèi)的免疫穩(wěn)態(tài)。


原文鏈接：

Engineered Extracellular Vesicle-Based Nanoformulations That Coordinate Neuroinflammation and Immune Homeostasis, Enhancing Parkinson''''s Disease Therapy. ACS Nano. 2024 Aug 15. doi: 10.1021/acsnano.4c04674.

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c04674

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