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  近日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)王育才/李敏團(tuán)隊(duì)在《Nature Biomedical Engineering》在線發(fā)表研究論文，提出了一種基于活體篩選優(yōu)化的低免疫原性LNPs遞送PD-L1 mRNA的策略，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)直接生成tol-APCs。研究團(tuán)隊(duì)利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE），系統(tǒng)篩選LNPs的N/P比及脂質(zhì)組成，并通過活體篩選評(píng)估免疫原性，最終篩選出既能高效轉(zhuǎn)染APCs、又不誘導(dǎo)免疫激活的最優(yōu)LNPs配方。優(yōu)化后的LNPs可在體內(nèi)精準(zhǔn)遞送PD-L1 mRNA，使APCs高效表達(dá)PD-L1，同時(shí)避免炎癥信號(hào)激活。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和潰瘍性結(jié)腸炎模型中，該策略能夠選擇性抑制致病T細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)Treg擴(kuò)增，突破了mRNA技術(shù)在免疫調(diào)控中的應(yīng)用局限，開辟了“體內(nèi)耐受性免疫細(xì)胞工程”新方向（圖1）。

  相比于傳統(tǒng)mRNA遞送系統(tǒng)（如COVID-19疫苗所用的LNPs），本研究?jī)?yōu)化的低免疫原性LNPs能夠精準(zhǔn)靶向APCs，避免其表面共刺激分子（CD80/CD86/CD40）的異常上調(diào)，減少炎癥反應(yīng)，同時(shí)保證mRNA的高效表達(dá)。這一策略不僅為mRNA技術(shù)在自身免疫疾病治療領(lǐng)域提供了新的可能，也為“體內(nèi)耐受性免疫細(xì)胞工程”奠定了基礎(chǔ)。

圖1. 低免疫原性遞送mRNA生成tol-APCs用于自身免疫性疾病治療。

低免疫原性LNPs的定向設(shè)計(jì)與優(yōu)化

  傳統(tǒng)mRNA遞送系統(tǒng)（如COVID-19疫苗使用的LNPs）通過激活A(yù)PCs表面的共刺激分子（CD80/CD86/CD40）介導(dǎo)強(qiáng)效免疫應(yīng)答，但這與自身免疫病治療所需的免疫抑制目標(biāo)相矛盾。為解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）系統(tǒng)調(diào)整LNPs的四種組分（SM-102、DSPC、DMG-PEG2000、膽固醇）的摩爾比例與N/P比，構(gòu)建LNPs庫。通過Taguchi正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，并通過兩輪篩選，確定了具有低免疫原性、高表達(dá)效率的LNP配方。該配方顯著降低APC表面共刺激分子CD80/CD86/CD40的表達(dá)水平，同時(shí)保持轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定。使用該配方LNPs封裝編碼PDL1的mRNA（LNPs/mPDL1），并經(jīng)小鼠皮下注射后，淋巴結(jié)CD11c⁺和CD11b⁺細(xì)胞PDL1表達(dá)顯著升高，說明了tol-APCs的成功生成，而骨髓中未檢測(cè)到tol-APCs生成，且LNPs/mPDL1對(duì)非APC的免疫細(xì)胞影響極小，表明經(jīng)優(yōu)化的LNPs成功實(shí)現(xiàn)低免疫原性遞送PDL1 mRNA至APCs，實(shí)現(xiàn)tol-APCs的在體生成（圖2）。

圖2. LNP優(yōu)化策略以實(shí)現(xiàn)低免疫原性遞送mRNA。

1. 從體外到體內(nèi)的tol-APCs生成與功能驗(yàn)證

  體外模型中，DC2.4（樹突狀細(xì)胞系）和RAW264.7（巨噬細(xì)胞系）經(jīng)LNPs/mPDL1處理后，表面PDL1蛋白表達(dá)量顯著提升2-3倍，證實(shí)其向tol-APCs的轉(zhuǎn)化能力。而在體內(nèi)模型中，LNPs優(yōu)先靶向淋巴結(jié)和脾臟中的CD11c⁺/CD11b⁺ APC細(xì)胞，表面PDL1陽性率顯著提高，而非APC細(xì)胞幾乎無表達(dá)。此外，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，LNPs/mPDL1處理后，tol-APCs的在體生成可維持4天左右，保證了其生成的有效性與可調(diào)控性（圖3）。

圖3. LNP/mPDL1誘導(dǎo)生成tol-APCs。

  研究團(tuán)隊(duì)隨后對(duì)生成的tol-APCs功能進(jìn)行驗(yàn)證。PD1在活化的T細(xì)胞中通常呈現(xiàn)高表達(dá)，而在初始T細(xì)胞中表達(dá)水平較低，其在防止T細(xì)胞過度活化和促進(jìn)免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究團(tuán)隊(duì)使用CD3/CD28激動(dòng)性抗體（αCD3/CD28）刺激T細(xì)胞高表達(dá)PD1，來模擬活化的T細(xì)胞狀態(tài)，并與LNPs/mPDL1體外誘導(dǎo)生成的tol-APCs共培養(yǎng)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示tol-APCs顯著促進(jìn)活化T細(xì)胞的凋亡，而對(duì)未活化T細(xì)胞無影響，提示其通過PDL1/PD1通路選擇性抑制活化T細(xì)胞。類似地，tol-APCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，流式細(xì)胞檢測(cè)到活化CD4⁺ 和CD8⁺ T細(xì)胞的增殖均顯著降低（圖4）。

圖4. LNP/mPDL1生成的tol-APCs在體外減少活化T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

  此外，該研究通過過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)探究了LNPs/mPDL1誘導(dǎo)的體內(nèi)tol-APCs對(duì)活化T細(xì)胞抑制作用的選擇性。分離Balb/c小鼠脾臟T細(xì)胞并對(duì)部分T細(xì)胞刺激活化，將活化/未活化T細(xì)胞按1:1比例混合后過繼轉(zhuǎn)移到LNPs/mPDL1處理后BALB/c裸鼠體內(nèi)（最小化宿主免疫系統(tǒng)的影響）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)了受體小鼠體內(nèi)成功生成耐受性DCs，同時(shí)與對(duì)照組相比，LNPs/mPDL1處理組活化T細(xì)胞比例顯著減少，T細(xì)胞中活化T細(xì)胞/非活化T細(xì)胞的比值也顯著降低。LNPs/mPDL1在體內(nèi)選擇性減少CD4⁺ 和CD8⁺ 活化T細(xì)胞比例的同時(shí)，也增加了非活化T細(xì)胞的比例。這些結(jié)果表明，皮下注射的LNPs/mPDL1能夠選擇性地清除過度活化的T細(xì)胞，同時(shí)對(duì)靜息T細(xì)胞影響極小，凸顯了該方法的特異性與治療的安全性（圖5）。

圖5. tol-APCs選擇性減少體內(nèi)活化T細(xì)胞。

2. 媲美臨床藥物誘導(dǎo)免疫抑制的效果

  隨后，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了疾病模型來驗(yàn)證LNPs/mPDL1對(duì)自身免疫病模型的治療效果。在Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）模型中，DBA/1小鼠經(jīng)LNPs/mPDL1治療后，關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分顯著降低，且軟骨損傷程度接近正常水平（通過番紅固綠染色評(píng)估）。滑膜組織免疫組化分析顯示，IFN-γ和TNF-α的表達(dá)量水平降低，CD4⁺ 和CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)減少，而Tregs比例增加。值得注意的是，治療組的關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分與TNF-α抑制劑依那西普相當(dāng)，證實(shí)LNPs/mPDL1有效緩解RA癥狀（圖6）。

圖6. LNP/mPDL1體內(nèi)生成的tol-APCs抑制RA進(jìn)展。

  研究團(tuán)隊(duì)隨后對(duì)LNPs/mPDL1在另一自身免疫疾病——潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型的治療效果進(jìn)行了評(píng)估。C57BL/6小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)后出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)腸縮短（平均長(zhǎng)度5.6 cm）和黏膜損傷。LNPs/mPDL1治療組結(jié)腸長(zhǎng)度恢復(fù)至正常水平（6.6 cm），且黏膜結(jié)構(gòu)完整，隱窩破壞顯著緩解，且其治療效果與環(huán)孢素相當(dāng)。同時(shí)LNPs/mPDL1治療顯著減少腸道炎癥部位的CD4⁺ 和CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)，增加了Treg數(shù)量，并降低TNF-α水平；此外，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，LNPs/mPDL1顯著降低了腸系膜、腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和血液中的效應(yīng)T細(xì)胞（圖7）。

圖7. 體內(nèi)生成的tol-APCs在UC小鼠模型中發(fā)揮治療作用。

  該團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化LNPs的N/P比與脂質(zhì)組成，顯著降低載體免疫原性，使APCs特異性高表達(dá)PD-L1而不引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而精準(zhǔn)抑制致病性T細(xì)胞活性并擴(kuò)增Treg。在RA和UC模型中，其療效優(yōu)于臨床標(biāo)準(zhǔn)藥物依那西普與環(huán)孢素，且單次治療成本不足傳統(tǒng)體外細(xì)胞療法的1%，兼具高效性與經(jīng)濟(jì)性。研究突破傳統(tǒng)療法的三大局限：無需體外操作，皮下注射直接靶向APCs；廣譜適應(yīng)，非抗原特異性模式適用于病因不明的自身免疫�。ㄈ鏤C），而加載特定抗原可拓展至多發(fā)性硬化癥等疾��；平臺(tái)化擴(kuò)展，未來可整合CTLA-4等共抑制分子或趨化受體增強(qiáng)療效，或通過肝靶向遞送誘導(dǎo)移植免疫耐受。此項(xiàng)成果以“體內(nèi)細(xì)胞編程”理念，為自身免疫病、器官移植及蛋白替代療法提供全新范式，推動(dòng)個(gè)體化醫(yī)療向精準(zhǔn)免疫重塑邁進(jìn)。

  中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)劉洋博士、劉潛博士、博士生張寶文為該論文共同第一作者，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)王育才教授、李敏副教授為本文共同通訊作者；團(tuán)隊(duì)其他成員及合作者也為本研究做出了重要貢獻(xiàn)。

  原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-025-01373-0