蔡仲雨教授團隊《Prog. Mater. Sci.》綜述: 基于蛋白質(zhì)/肽的刺激響應(yīng)型水凝膠及其傳感應(yīng)用
刺激響應(yīng)性水凝膠是一種含有大量水的三維智能材料，可對不同的外界刺激做出響應(yīng)。典型的聚合物水凝膠可以以低成本設(shè)計并應(yīng)用于多種刺激。然而，這些聚合物水凝膠缺乏特異性，對特定生物刺激或生物分子的感知能力較差。使用蛋白質(zhì)、多肽、適配體等生物分子制備新興刺激響應(yīng)性水凝膠是解決上述問題的有效策略。
近期，北京航空航天大學(xué)蔡仲雨團隊在《Progress in Materials Science》上發(fā)表了題為《Stimuli-responsive hydrogels based on protein/peptide and their sensing applications》的綜述。文章對近年來快速發(fā)展的基于蛋白質(zhì)/多肽的刺激響應(yīng)性水凝膠領(lǐng)域的最新進展進行了詳細的討論與總結(jié)，強調(diào)了由不同構(gòu)建單元制備的基于蛋白質(zhì)/多肽的水凝膠以及它們獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，回顧了基于蛋白質(zhì)/多肽的刺激響應(yīng)性水凝膠在物理、化學(xué)和生物傳感器應(yīng)用方面的最新進展，討論了其當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)并展望了未來的發(fā)展方向（圖1）。
圖1 刺激響應(yīng)性蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠的構(gòu)建單元及由其構(gòu)建的傳感器。
蛋白質(zhì)/多肽類聚合物是制備螺旋交聯(lián)水凝膠的主要原料，其性能可精確調(diào)控。隨著對蛋白質(zhì)和多肽認識的不斷深入，研究人員開發(fā)了一系列天然的螺旋形成肽，如膠原肽和亮氨酸拉鏈，它們被用作各種水凝膠的交聯(lián)位點。卷曲螺旋是由兩個或多個相互纏繞的α螺旋形成的超螺旋結(jié)構(gòu)。它們的形成是由不同的非共價相互作用驅(qū)動的，比如疏水相互作用、范德華力和電荷-電荷相互作用。研究人員可以通過調(diào)整聚合物鏈的序列、長度和數(shù)量來設(shè)計超螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，進一步精確地調(diào)整水凝膠網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)。了解卷曲螺旋的機制可以更好地制造螺旋交聯(lián)水凝膠。左手卷曲螺旋具有七肽重復(fù)序列，其中七個氨基酸殘基表示為“a-b-c-d-e-f-g”。按此順序，“a”和“d”位置大多為非極性疏水殘基，而其他位置則包含親水殘基。右手卷曲螺旋通常具有十一個氨基酸的重復(fù)序列。超螺旋的形成是通過卷曲螺旋的扭曲而發(fā)生的，這些穩(wěn)定的卷曲螺旋堆積促進了疏水核心的形成，可用于封裝疏水分子和 DNA。卷曲螺旋內(nèi)的疏水核心可以作為藥物載體用于藥物輸送。將卷曲螺旋作為交聯(lián)點可以作為一種通用的設(shè)計策略來制備許多新型蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠（如圖2所示）。
圖2 (A) 卷曲螺旋肽自組裝形成動態(tài)水凝膠的示意圖。(B) (i) γPFD-K2E2水凝膠自組裝示意圖。預(yù)折疊蛋白的C端用帶負電 (E-coil) 肽和帶正電 (K-coil) 肽的交替片段進行修飾。(ii) 用K2E2卷曲修飾的γPFD 和γPFD 的 TEM 圖像。(iii) 倒置管中形成的預(yù)折疊蛋白水凝膠的照片。(C)丙烯；L-PHPG 和丙烯；DL-PHPG 交聯(lián)的水凝膠網(wǎng)絡(luò)示意圖。
基于肽的β片層和β發(fā)夾是通過協(xié)同非共價相互作用（包括氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用）形成的。形成β片層的肽通常由陽離子、疏水和陰離子氨基酸殘基的交替序列組成，所得的片層相互結(jié)合，產(chǎn)生纏繞的纖維原或彎曲的肽表面。一些纖維原通過分支交聯(lián)點連接，形成獨立的水凝膠網(wǎng)絡(luò)。β片層和β發(fā)夾水凝膠的協(xié)同分子間相互作用使其具有獨特的性能。具體而言，源自β片層的水凝膠在高溫、高鹽濃度和變性劑存在條件下仍然保持了顯著的穩(wěn)定性。由于傷口環(huán)境中通常存在高濃度的蛋白酶，因此這種具有極佳穩(wěn)定性的水凝膠有望用作傷口敷料。此外，這些水凝膠在植入生物體后通常不會引起炎癥或強烈的免疫反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，因為由于人體的異物反應(yīng)，植入式水凝膠被封裝后其有效性會顯著降低。最近，許多研究者通過利用多肽的 β 片層和 β 發(fā)夾肽構(gòu)象變化開發(fā)蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠（如圖3所示）。
圖3 (A) Fmoc-F/PAAm雜化雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的凝膠化過程示意圖。(B) 由一系列新型超短膠原蛋白模擬三肽和非膠原蛋白水凝膠劑共組裝而成的雜化水凝膠的設(shè)計。(C) PAH/Fmoc-FFpY 超分子水凝膠的示意圖：(i) PAH和Fmoc-FFpY之間的靜電相互作用，導(dǎo)致(ii) 通過Fmoc-FFpY和PAH溶液的簡單混合制備PAH/Fmoc-FFpY水凝膠。(D) (i) AP對Fmoc-FFpY進行去磷酸化，生成膠凝劑Fmoc-FFY：示意圖 (ii) Fmoc-FFY 納米纖維（藍色）由 NPs@AP 通過 Fmoc-FFpY 去磷酸化自組裝而成，生成 (iii) 混合超分子水凝膠，該水凝膠隨時間發(fā)生相分離。
蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠的一個特別有益的特性是，它們的動態(tài)特性源自蛋白質(zhì)/多肽與特定生化配體的反應(yīng)引起的構(gòu)象變化。最近，經(jīng)歷三級構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)/多肽也被納入水凝膠網(wǎng)絡(luò)中。在折疊過程中，蛋白質(zhì)和肽會重新組織其層次結(jié)構(gòu)，以達到最小自由能狀態(tài)。配體的結(jié)合會改變蛋白質(zhì)的能量格局，促使蛋白質(zhì)或肽折疊成不同的三級結(jié)構(gòu)，這可能涉及重新配置的螺旋、β-發(fā)夾、β-折疊和/或非結(jié)構(gòu)化區(qū)域。構(gòu)象變化是不同蛋白質(zhì)/肽家族中的常見現(xiàn)象。事實上，已知大量蛋白質(zhì)/多肽會發(fā)生構(gòu)象變化，這些變化已被徹底表征。蛋白質(zhì)/肽構(gòu)象變化可分為具有不同特征的蛋白質(zhì)/肽運動。其中，代表性的例子是“鉸鏈運動”和“剪切運動”。“鉸鏈運動”是蛋白質(zhì)或多肽運動的一大類，可發(fā)生在α-螺旋或β-片層的末端區(qū)域。此外，蛋白質(zhì)和多肽還會產(chǎn)生“剪切運動”，涉及在具有分層結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)內(nèi)成對垂直螺旋之間的界面處高達100度的旋轉(zhuǎn)。如上述例子和其他例子所示，二級結(jié)構(gòu)的排列對于確定蛋白質(zhì)/肽的潛在三級運動至關(guān)重要。此外，引入響應(yīng)性聚合物是獲得動態(tài)蛋白質(zhì)/肽水凝膠系統(tǒng)的另一種有效方法。響應(yīng)性聚合物通常通過改變其物理或化學(xué)性質(zhì)來對環(huán)境變化做出反應(yīng)，例如溫度（PNIPAM）、pH（聚丙烯酸）、離子（聚電解質(zhì)）和光（含偶氮苯的聚合物）。一系列物理刺激，化學(xué)刺激或生物刺激（如圖4所示）下可進行響應(yīng)的動態(tài)蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠被總結(jié)。
圖4 (A) 化合物1-4的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及可能的反應(yīng)方案，展示了暴露于各種小分子時凝膠到溶膠的相變。(B) (i) 抗原抗體半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠暴露于游離抗原時膨脹的機制。(ii) 抗原抗體半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法。(C) 與AKtm/DTT 交聯(lián)的HPMA基水凝膠以及水凝膠在底物作用下的宏觀運動。
雖然大多數(shù)蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠都依賴于上述先進制備策略，但也有一些蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠可以通過交聯(lián)單體直接實現(xiàn)制備。蛋白質(zhì)和肽由多種氨基酸組成，這意味著這些氨基酸可以作為交聯(lián)位點來形成蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠。高反應(yīng)效率和溫和的反應(yīng)條件對于制備保留活性的蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠非常重要。因此，仔細選擇化學(xué)反應(yīng)和蛋白質(zhì)或多肽中的氨基酸殘基至關(guān)重要。在各種天然氨基酸殘基中，一些氨基酸和功能團經(jīng)常被用作交聯(lián)位點，例如賴氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和對疊氮基苯丙氨酸等。
圖5 (A) Con A-白色念珠菌表面甘露聚糖結(jié)合示意圖。(B) (i)葡萄糖誘導(dǎo)的GGBP構(gòu)象變化 (ii)葡萄糖結(jié)合誘導(dǎo)的2D PC GGBP水凝膠VPT引起衍射藍移。(C) 2D PC HRP/BSA 蛋白復(fù)合水凝膠傳感器選擇性檢測H2O2伴隨紅移。(D) (i)用于制作PNC-BSA水凝膠的單步蛋白質(zhì)展開-化學(xué)偶聯(lián) (PNC) 方法；(ii) BSA 分子內(nèi)羧基和氨基之間發(fā)生的EDC/NHS偶聯(lián)反應(yīng)。
在此基礎(chǔ)上，文章總結(jié)了近年來基于蛋白質(zhì)/肽的刺激響應(yīng)性水凝膠作為傳感器的應(yīng)用（如圖5和圖6所示）。根據(jù)成分可以將基于蛋白質(zhì)/肽的水凝膠分為純蛋白質(zhì)水凝膠傳感器或者雜化蛋白質(zhì)/肽水凝膠傳感器。蛋白質(zhì)水凝膠因其獨特的分子識別能力而具有重要的生物技術(shù)應(yīng)用。利用蛋白質(zhì)水凝膠制備的傳感器具有選擇性好、生物相容性好、可生物降解、細胞毒性低、免疫原性高等優(yōu)點，在臨床診斷、疾病監(jiān)測等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。而將聚合物與蛋白質(zhì)/肽結(jié)合形成雜化蛋白質(zhì)/肽水凝膠具有引入新特性的潛在優(yōu)勢。具體來說，蛋白質(zhì)/肽通常對各種刺激表現(xiàn)出獨特的響應(yīng)性，合成聚合物則具有更好的機械強度和多樣化的單體結(jié)構(gòu)，而現(xiàn)代可控聚合技術(shù)的發(fā)展為控制各種聚合物的重要結(jié)構(gòu)參數(shù)提供了有效的方法；诘鞍踪|(zhì)/多肽的刺激響應(yīng)性水凝膠已經(jīng)在物理傳感器，化學(xué)傳感器和生物傳感器方面得到了廣泛的應(yīng)用。
圖6 (A) (i) 開發(fā)激酶響應(yīng)CCA生物傳感器。(ii) 使用肽底物 (LRRASLG) 對水凝膠進行功能化，該肽底物在暴露于蛋白激酶A (PKA) 時會膨脹。(iii) 隨著固定的帶負電基團濃度的增加（在pH=5.5時），觀察到水凝膠封裝的CCA的峰值光學(xué)反射率發(fā)生紅移，同時水凝膠中的顏色發(fā)生變化。(B) (i) 利用點擊化學(xué)對肽進行功能化，創(chuàng)建具有光學(xué)衍射特性的激酶響應(yīng)水凝膠。(ii) 光學(xué)衍射水凝膠響應(yīng)激酶磷酸化。由于肽功能化和磷酸化引起的晶格間距變化，水凝膠會發(fā)生可逆性溶脹和顏色變化。
此外，基于上述智能凝膠材料，刺激響應(yīng)性蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠還被制備成可穿戴的智能傳感器，用于監(jiān)測人體生理特征及健康監(jiān)測（圖7）。
圖7 (A) PAAm/酪蛋白水凝膠示意圖。(B) (i) LysMA 的合成途徑和 (ii) 聚 (LysMA-co-AAm) 水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。(C) P(AAm/AMPS)-AFPS 水凝膠的制備示意圖。(D) 具有各種可調(diào)性能的水凝膠示意圖及其在可穿戴傳感系統(tǒng)中的應(yīng)用。
最后，文章對刺激響應(yīng)性蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀進行了總結(jié)，討論了該領(lǐng)域中面臨的挑戰(zhàn)，提出了相應(yīng)的解決思路，并對未來的發(fā)展方向進行了展望（圖8）。
圖8 刺激響應(yīng)性蛋白質(zhì)/多肽基水凝膠領(lǐng)域的總結(jié)與展望。
上述工作得到了國家自然科學(xué)基金、國家青年人才項目、陜西省科技資源開放共享平臺項目等的資助。北京航空航天大學(xué)博士研究生趙芳媛是論文第一作者，蔡仲雨教授為論文的通訊作者。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.pmatsci.2024.101355
